紫外分光光度法
| 实验方法原理 |
当DNA 的稀盐溶液加热到80～100 ℃ 时, 双螺旋结构即发生解体, 两条链分开, 形成无规线团。一系列物化性质也发生改变: 260 nm 区紫外吸收值增高(增色效应) , 粘度降低, 浮力密度降低等。DNA 的变性的特点是爆发式的, 变性作用发生在一个很窄的范围。通常把DNA 的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA 的熔点或熔解温度( melting temperature ) , 用Tm 表示。DNA 的Tm 值一般在70～85 ℃之间。
DNA 的Tm 值大小与下列因素有关:
1. DNA 的均一性。均一性越高的样品, 熔解过程越是发生在一个很小的温度范围。
2. G-C 的含量。含量越高, Tm 越高, 由Tm 值可推算出GC含量。其经验公式为: ( G-C)% = ( Tm - 69.3 ) ×2.44。
3. 介质中的离子强度。一般离子强度较低的介质中DNA的熔解度较低, 熔解度的范围也较宽。
Tm 值的测定与变性条件的研究可为我们提供有关DNA 核苷酸组成的信息, 同时也有助于判断DNA 的纯度与数量。 |
|---|---|
| 实验材料 | DNA |
| 试剂、试剂盒 | 氯化钠 柠檬酸 乙二醇 |
| 仪器、耗材 | 紫外分光光度计 石英杯 |
| 实验步骤 |
1 . 用循环恒温装置测Tm 按操作规程打开紫外分光光度计预热20 min。设定循环恒温装置于25 ℃ , 进行光吸收的初步测定。若是自制DNA, 先于25 ℃测其A260 , 用标准氯化钠-柠檬酸溶液稀释至A260 = 0.4。并注意使其终体积适合于比色杯( 1 ml或3 ml)。 的样品室中, 平衡3 min 后测A260 。再将温度升高到50 ℃ , 取出比色杯将其内壁的气泡赶出,测A260 。继续升温到80 ℃ , 平衡5 min 后测A260 。
按每次升高2 ℃ 的方式升温, 然后平衡温度( 5 min ) , 记录A260 。按此方式一直进行到A260 不再升高为止。 最少设定6 个恒温水浴装置( 50 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃) 。按操作规定预热紫外分光光度计20 min。
DNA 溶液的浓度控制在A260 = 0.4。取试管( 最少8 支) , 向其中各加入3 ml DNA 溶液, 盖上帽子, 温育15 min。其中一支试管放室温, 两支试管放100 ℃ , 其余温度水浴各一支, 温育完后迅速冷却试管, 室温和100 ℃一支置于冰浴10 min , 而另一支100 ℃则缓慢冷却到室温。 计算各温度下的A260 ( t)/ A260 ( 25 ℃ ) , 并以此比值对温度作图,连接各点成平滑曲线, 估计出光吸收增加的中点, 此即Tm 。计算G-C%含量。
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