酸性磷酸酯酶动力学性质分析
米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm)的测定
[原理]
在温度、pH及酶浓度恒定的条件下,底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时,酶促反应的速度(v)随底物浓度的增加而迅速增加;随着底物浓度的继续增加,反应速度的增加开始减慢;当底物浓度增加到某种程度时,反应速度达到一个极限值(Vmax)。
底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示:
式中
v——反应速度;
Km——米氏常数;
Vmax——酶反应最大速度;
[S] ——底物浓度。
从米氏方程式可见:米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度,米氏常数的单位就是浓度单位(mol/L或mmol/L)。
在酶学分析中,Km是酶的一个基本特征常数,它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关,与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应,在一定条件下都有其特定的Km值,因此可用于鉴别酶。
测定Km、Vmax,一般用作图法求得。作图法有很多,最常用的是Linewaver-Burk作图法,该法是根据米氏方程的倒数形式,以1/v对1/[S]作图,可得到一条直线。直线在横轴上的截距为 -1/Km,纵截距为1/Vmax,可求出Km与Vmax。
[方法和步骤]
1、制作标准曲线
取9支 试管 ,按0~8编号。
1~8号管分别加入0.1至0.8mL酚标准应用液,并用蒸馏水将各管体积补充至1.0mL,0号管中加入1.0mL蒸馏水。各管各加1mol/L碳酸钠溶液2.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL,摇匀后,35℃保温显色10分钟。以0号管作空白,在可见光分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度A 680 。
整个操作过程见下表:
管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 0 |
酚含量/μmol | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.20 | 0.24 | 0.28 | 0.32 | - |
0.4mmol/L酚标准应用液/mL | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | - |
蒸馏水/ mL | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.6 | 0.5 | 0.4 | 0.3 | 0.2 | 1.0 |
1mol/L碳酸钠溶液/ mL | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Folin-酚稀溶液/mL | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
以酚含量(μmol)为横座标,以A 680 为纵坐标,绘制标准曲线。
2、测定Km、Vmax
取 试管 7支,按照0~6编号,空白管为0号。各管按下表加入不同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液(pH5.6),并分别补充0.2mol/L pH5.6乙酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min后,逐管记时加入酸性磷酸酯酶酶液0.5mL,摇匀,精确反应15min。各管反应时间到达后立即加入1mol/L碳酸钠溶液2mL,摇匀,再加入Folin-酚稀溶掖0.5 mL,35℃保温显色l 0min。0号管内最后加入0.5 mL酶液,其它操作与上述各管相同。冷却后以0号管作空白,在可见光型 分光光度计 680nm波长处读取各管的吸光度A 680 。
在温度、pH及酶浓度恒定的条件下,底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时,酶促反应的速度(v)随底物浓度的增加而迅速增加;随着底物浓度的继续增加,反应速度的增加开始减慢;当底物浓度增加到某种程度时,反应速度达到一个极限值(Vmax)。
管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 0 |
磷酸苯二钠终浓度/ mmol×L -1 | 0.5 | 0.75 | 1.0 | 1.25 | 1.50 | 2.50 | |
5 mmol/L磷酸苯二钠/ mL | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 | 0.30 | 0.50 | 0.5 |
0.2mmol/L乙酸盐 缓冲液 / mL | 0.4 | 0.35 | 0.30 | 0.25 | 0.20 | 0 | 0 |
稀释酶液/ mL | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 (最后加入) |
1mol/L碳酸钠溶液/ mL | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Folin-酚稀溶液/mL | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
A 680 |
[结果与计算]
1、从酚标准曲线上查出各管A 680 相当的酚含量,计算各种底物浓度下的反应初速度v。
2、以1/v为纵坐标,1/[S]为横坐标作图,求出Km和Vmax。