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DNA提取中的常见问题分析2

2019.11.03
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zhaochenxu

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A260/280比值较低?或者A260/280比值较高?


参考见解:用水作为洗脱液比较偏低,或者蛋白质残留,但如果操作过程中使用了苯酚,则更可能是苯酚残留。而比较高可能是大量RNA残留,没有使用RNaseA,或RNaseA活性下降。A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差则为苯酚残留。



DNA影响后续酶反应试验?


参考见解:


1、 在洗脱液中有残留的漂洗液GW,可通过再次的离心去除硅胶膜上的GW。

2、 大量RNA残留。



在缓冲液GA GB 中有白色沉淀?


参考见解:白色沉淀可能使由于低温或长时间放置产生,可在使用前在56℃重新加热融解。



在操作中加入缓冲液GB有白色沉淀?


参考见解:在缓冲液GB加入后产生的白色沉淀在70℃温浴时会消失,不会影响下游的操作。



CTAB法提取DNA,CTAB为什么要预热?


参考见解:


1、 CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。

2、 促进CTAB更好的溶解,以提高其释放植物组织中DNA的效率,先达到了反应温度,这样实际作用时间要比不预热短一些。



在用CTAB法提取玉米嫩叶DNA,所取到的DNA为什么是黄色或黑色而不是呈白色?


参考见解:


1、 可能是色素的问题,不同的材料会出现不同的颜色,用这些应当可以P出来东西。

2、 你取样的时候带上了别的东西 ,或者洗涤的时候没有洗干净。



CTAB法抽提DNA,95%的乙醇沉淀后,用1/10体积3mol/L的NaAc(pH5.2)和1体积的76%的乙醇洗涤后,自然晾干后加65度的TE(pH8.0),TE的量并不少,可总是溶的不好,什么原因?


参考见解:不能溶解不要紧,离心机大力离心后取上清,加入无水乙醇沉淀后在用TE重悬,提取的DNA要纯些。也可以吸取溶解了的TE液加入异丙醇再次沉淀。


用CTAB法抽提的,CTAB和DTT(二硫苏糖醇)混合后加入磨碎的叶子中,65度30分,后用氯仿/异戊醇去蛋白,吸上清加异丙醇,但没有看见DNA,叶子的量很多,取的是四叶期最老的叶子。为什么?



参考见解:老叶子破壁困难,DNA难以释放出来。


1、 尽量磨细叶片,最好用液氮反复几次研磨为粉末状;

2、 延长CTAB的作用时间,期间不时摇匀。


也可能由于叶子量太大,而CTAB量少,导致得到的液体粘稠,无法混匀,细胞破裂不完全,DNA少;可试着用大的离心管,多加入CTAB,65度温浴并不时地摇匀。



抽提过程中的现象及可能的原因?


参考见解:


1、 核酸不溶解或者难溶解 – 蛋白质残留 (虽然目前更多的资料强调的是过分干燥所致。)。75% 乙醇洗涤后,如果是空气干燥,几乎不可能过分干燥的,尤其是在南方潮湿的地方。佐证实验:撕取少量 Merck 的丝状CT DNA 到一个离心管中,加入无水乙醇;10 分钟后彻底去除乙醇;待乙醇完全挥发后,加入 TE,10 分钟后溶液就非常均匀而粘稠了。


2、 使用异丙醇沉淀核酸,沉淀为白色 – 多糖残留。


3、 核酸溶解后为乳白色 – 多糖残留。


4、 75% 乙醇洗涤异丙醇沉淀的核酸时,沉淀变大了。



降解的现象、原因及对策?


参考见解:降解的现象,如果抛开问题电泳所致,可以简单总结如下:主带不再突出,向小片段方向发生弥散,亮度比较均衡地衰减。如果同时还伴随下列的一个或者多个现象,则需要更进一步的检测:加样孔非常的亮、弥散发生在主条带位置的上下两个方向、从加样孔即开始发生弥散。以现在的裂解液的裂解能力而言,降解的发生主要是在彻底匀浆之前,只有极少量由不干净的溶解液导致。以总 RNA 抽提为例,本站就有帖总结为:总 RNA 的质量由高到低依次为悬浮细胞、贴壁细胞、组织 (此处的质量不仅指纯度,也指完整性才对)。彻底裂解悬浮细胞的时间最短,彻底裂解组织的时间最长,这就是降解多发生在彻底匀浆之前的一个佐证。再看一看新鲜样品和冷冻保存样品,非常严格的冷冻保存和匀浆操作的确可以确保冷冻样品的核酸的质量;但是,有许多实验室并不具备严格的保存手段,实验人员的操作也并非完美,其结果就是核酸的降解。


RNA 抽提受的影响因素太多,就以基因组 DNA 的抽提为例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K 的溶液,无论你使用的是新鲜样品还是冷冻保存样品,如果混匀彻底,可以预期的降解为:细胞 – 不应该降解,碾碎的组织 – 不应该降解,大块组织 (包括鼠尾) – 部分降解。如果电泳发现新鲜的细胞和碾碎的新鲜组织发生了降解现象,该现象是假象;如果电泳发现冷冻的细胞和碾碎的冷冻组织发生了降解现象,该现象不是假象,就是样品在保存中已经降解了。说得更极端一点,即使蛋白酶 K 失活了,消化试剂的裂解能力也足以保证细胞的基因组 DNA 在抽提过程中间不被降解。减少或者杜绝核酸降解,一定要将重点放在样品被彻底匀浆之前。样品的保存在前面已经说过了,不重复。其次就是要缩短样品从脱离原来的生存环境或者低温到被彻底匀浆之间的时间。



后续酶反应失败?


参考见解:首先从资料书中着手。如果三次实验后,问题还没有解决,那么 90% 的可能在于洗涤方式的不严格导致的小分子物的残留。小分子物像刀,可以陆续“杀”死很多酶;大分子物如蛋白质,像绳子,只能“捆住”一个目的核酸或者酶。更严格的洗涤可以解决该问题。



蛋白质是如何残留的?


参考见解:


1、 PC 纯化:a-取上清时取到中间层及下层;b- PC 用量不足;c-混匀不彻底;d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白质。


2、 高盐沉淀:a-取上清时取到了蛋白沉淀;b-裂解不彻底;c-裂解液用量不足,使裂解体系太粘稠;d-溶解度问题 (可以使用低温沉淀加以改善)。介质:a-裂解不彻底;b-裂解体系太粘稠。



小分子物质 (苯酚、盐) 是如何残留的?


参考见解:


1、 醇沉淀:洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。

2、 介质:颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致,极少数由操作者未严格按要求操作所致。



核酸抽提中的温度问题?


参考见解:核酸抽提中的温度问题,也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是,任何一个温度条件,对某些方面有利,同时也一定会有不利的一面。如沉淀,低温操作会提高得率,但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好,应该是利弊权衡的结果。基本上,除了一些特殊的步骤,如消化等外,用室温是最好的选择。那些认为“低温操作可以防止或者减少降解”之类的理由,并没有多少可操作性的。低温的确可以减低酶的活性,但低温同时也降低了这些酶被裂解液中的试剂灭活或者抑制的速度,此消彼长,没有办法给出结论的。就 RNA 抽提而言,彻底匀浆前在冰上操作可以降低 RNA 被降低的风险,彻底匀浆后的温度对 RNA 的完整性影响已经不会大的;如果发现影响很大,说明 RNase 没有被裂解液有效抑制,提示裂解液的用量不足。更没有道理的是认为低温沉淀和低温洗涤可以防止降解了。事实上,核酸一旦被沉淀下来,对酶的耐受力是很强的,这就是核酸保存在醇溶液中最稳定的理论基础。如果说沉淀使用低温还可以提高得率,洗

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