蛋白提取的常见问题分析

Q：如何进行组织液氮研磨？

A：将组织块在液氮里冻实，敲成大小合适的小块后放在研钵里，倒液氮，边研边加，保持研钵里有液氮，或是保持组织块不融。研碎了就行了。注意做前研钵等器具要预冷，用液氮或是先放负二十冰箱一段时间。

注意事项：1.液氮研磨的研钵，药勺必须预冷。2.开始研磨前，将研钵置于冰袋上，并加入少量的液氮，快速将样品转入其中。3.继续加入液氮，快速捣碎样品，然后快速研磨。4.待液氮挥发完前，继续加入液氮，快速淹没，重复操作，待样品变成非常细小的白色干粉时即可。5.将干粉刮下转入裂解液中，再加裂解液于研钵中，将其中的黏附的样品洗下。整个过程保持样品处于温度低的环境，研磨的速度要快而有力度。这样才能破碎细胞，同时不降解蛋白。

Q：膜蛋白不溶于loading buffer，或者煮沸后形成沉淀怎么办？

A：用60度变性1h；如果还是不行，把loading buffer的SDS换成LDS。

Q：多少细胞提的蛋白够做western blot？

A：一般5×10⁶足够。但要看是哪种细胞，有的细胞的体积就很小，而有的细胞则铺得很开。常规做WB一个孔道上样要10⁵个细胞。但也和目的蛋白及提取的方式有关。如果是膜蛋白或是某细胞器内分布的蛋白细胞数得增多。

Q：同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？

A：可以，甚至可以同时测十几种样品。

Q：蛋白提取后可以存放多久？

A：－80℃，一年没有问题。关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌污染

Q：提取蛋白后做WB一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？

A：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。

Q：做组织样品蛋白的western的时候，提取蛋白有什么特别注意的吗？

A：必须进行研磨、匀浆处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail）。