影响毛细管区带电泳色谱仪分离的操作条件

影响毛细管区带电泳色谱仪分离的操作条件有缓冲液、添加剂、分离电压和分离温度等。

一、缓冲液：

CZE分离过程在缓冲液中进行，缓冲液的选择直接影响粒子的迁移和分离。

配制缓冲液时，必须使用高纯蒸馏水和试剂。使用前要用0.45μm滤膜过滤以除去颗粒等。

1、缓冲液的选择须遵循的要求：

（1）在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量。

（2）在检测波长处无吸收或吸收值低。

（3）为达到有效的进样和合适的电泳淌度，缓冲液pH值至少与被测组分的等电点相差l个pH单位。

（4）自身淌度低，即分子大而荷电小，以减少电流的产生。

（5）只要条件允许，尽可能采用酸性缓冲液。在低pH值下，吸附和电渗流都很小，毛细管涂层的寿命较长。

（6）与毛细管种类匹配，涂层毛细管只能在一定pH范围内使用。

2、常用缓冲液：

常用缓冲液有硼砂、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和醋酸盐等。

3、缓冲液pH值：

（1）缓冲液pH值的选择与样品性质有关。

1）通常酸性组分选择在碱性条件下分离。

2）通常碱性组分选择在酸性条件下分离。

3）蛋白质、多肽和氨基酸等两性物质可选酸性（pH = 2）或碱性（pH＞9）分离介质。

4）糖类样品通常在pH = 9～11能获得zui优分离。

5）羧酸或其它样品多在pH = 5～9选择分离条件。

（2）缓冲液pH值的选择和毛细管种类有关。

很多涂层毛细管只能在一定pH范围内使用，如聚丙烯酰胺涂层毛细管只能在pH = 4～9使用，否则涂层易水解失效。

（3）在相同pH下，不同缓冲液的分离效果可能相差很大。

一般来说，能与样品发生相互作用的试剂可能是zui好的。如分离糖类和DNA等分子时应优先使用硼酸盐缓冲液，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，增加糖的负电荷和分离度。硼酸盐缓冲液也适用于分离其它含邻羟基和多羟基的化合物。

（4）为了选择合适的pH值，需要用pH调节剂调整介质的酸碱性。

由于多数缓冲试剂是酸性物质如磷酸，所以pH调节剂主要是碱类。常用pH调节剂有NaOH、KOH和Tris等。也可用胺和醇胺等有机碱如乙醇胺和乙二胺。如果缓冲试剂为碱类，可用酸作为调节剂，尽量使用弱酸如H₃PO₄。

缓冲试剂和调节剂的浓度对改善分离、抑制吸附和控制焦耳热等都有影响。一般缓冲试剂的浓度在10～200mmol/L，有时为了抑制蛋白质等的吸附作用，浓度可高达500mmol/L（此时应减少分离电压）。电导率大的缓冲试剂如磷酸盐和硼酸盐等的浓度一般在20mmol/L，电导率小的缓冲试剂如硼酸的浓度可在100mmol/L以上。

二、添加剂：

如果缓冲液经各种参数优化后仍无法给出良好的分离结果，可加入添加剂以改善分离。常用添加剂有：

1、无机电解质：NaCl和KCl等。

2、有机溶剂：甲醇和乙腈等。

3、非电解质高分子：纤维素、多糖、聚乙烯醇和Triton X－100等。

4.、功能性添加剂：手性冠醚和环糊精等。

三、分离电压：

分离效率与电压间存在极大值。极大电压通常也是zui优工作电压。

当毛细管很细或缓冲液电导很低时，极大电压可能会超出仪器范围。此时没有最优电压，可选择仪器允许的最大输出电压。

当毛细管较粗或缓冲液电导较高时，极大电压可能很小，若此时分离度很高，可选择大于极大值的电压进行分离。

四、分离温度：

毛细管的温度不仅影响分离的重视性，而且影响分离效率。温度选择应考虑热效应、分析重现性、分离效率和分离介质对温度的限制等因素。

温度应通过实验确定。多数情况下，在20～30℃进行电泳能获得良好的分离效果。一些糖类样品需要高于室温的分离条件，一些样品如蛋白质等可能需要低于室温的分离条件。