聚丙烯酰胺凝胶电泳仪分析技术（一）

聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的电泳技术，于1959年建立，1964年进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于分辨率高，目前已广泛用于蛋白质等生物大分子的分析。

一、PAGE工作原理：

聚丙烯酰胺凝胶具有高粘度和高摩擦阻力，电泳过程中能防止对流，把扩散减到zui小。凝胶具有多孔性，孔径与蛋白质分子大小大致相同，能产生分子筛效应，其分离既与电荷密度有关，又与分子大小有关，对分离不同相对分子量的生物大分子极为有利。

二、PAGE载体特性：

采用聚丙烯酰胺凝胶作为载体的目是防止电泳过程中分子的对流和扩散，使待测组分得到更有效的分离。载体应具备以下特性：

1、物理化学性质稳定，在电泳过程中不受环境因素的影响，保持原有的状态和性能。

2、化学惰性，在电泳过程中不与缓冲液中的离子和待分离的生物大分子发生化学反应，不干扰生物大分子的电泳过程。

3、分布均匀，电渗小，结果重复性好。

三、聚丙烯酰胺凝胶合成方式：

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（CH₂ = CH－CO－NH₂，简称Acr）和交联剂N，N′－甲叉双丙烯酰胺（CH₂ = CH－CO－NH－CO－CH = CH₂，简称Bis）在催化剂作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成不带电荷且具有分子筛性质的三维网状结构凝胶。参与反应的催化剂有两种成分，一种是引发剂，提供原始自由基，通过自由基传递，使单体Acr成为自由基，引发聚合反应；另一种是加速剂，加快引发剂释放自由基的速度。

聚丙烯酰胺凝胶的合成是通过提供氧游离基的催化，使体系发生氧化还原反应来完成，催化体系的实质是自由基催化的氧化还原过程。聚丙烯酰胺凝胶合成方式有化学聚合和光聚合。

1、化学聚合：

（1）原理：

引发剂过硫酸铵（AP）在加速剂N，N，N′，N′－四甲基乙二胺（TEMED）的催化下形成游离氧自由基，即S₂O₈²ˉ→ 2SO₄ˉ，硫酸自由基的氧原子激活单体Acr形成单体长链，交联剂Bis将单体长链间连成三维网状结构。

Acr和Bis决定孔径大小，AP和TEMED决定聚合速度。

（2）影响化学聚合的因素：

1）引发剂和加速剂的浓度：

引发剂和加速剂的浓度小，聚合速度慢。浓度过大，易导致电泳时烧胶和区带畸变。

一般使聚合过程在40～60min内完成。

2）系统pH：

在碱性pH时，聚合速度快。在酸性条件时，同样浓度的溶液，聚合速度慢。

存在一个最优pH，以获得最优聚合结果。

3）温度：

温度高，聚合速度快。温度低，聚合速度慢。

低温聚合时，凝胶会变得脆而浑浊，重复性差。在25℃聚合的凝胶，较透明，有弹性。

4）分子氧：

分子氧能使AP分解，导致自由基淬灭，阻止多聚体链长的增加。

进行化学聚合时，反应液应与空气隔绝。

5）系统纯度：

有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃和一些金属等会抑制聚合反应，反应液和容器表面接触的一层不能形成凝胶。

某些化学物质可减慢聚合速度。

（3）应用：

PAGE的分离胶（小孔胶）是通过化学聚合法制备而成。

2、光聚合：

（1）原理：

引发剂核黄素在加速剂TEMED和光照条件下，分解成无色的还原型（无色核黄素），在少量O₂条件下，还原型核黄素被O₂再氧化形成自由基，从而引发聚合反应。

（2）影响光聚合的因素：

1）需痕量氧原子存在，但过量的氧会阻止链长的增加。

2）核黄素用量少（4mg/100mL），生物样品不失活。

3）光源容易获取，改变光照量可控制聚合时间。光照量不易掌握，使凝胶孔径不稳定。

（3）应用：

光聚合的凝胶孔径大，适于制备PAGE的浓缩胶（大孔胶）。