1.构建OSC细胞模型--MG63/DXR
作者选择人的OS细胞系--MG63，通过阿霉素DXR诱导，建立了多药耐药性细胞株--MG63 / DXR。并通过分析其特定的细胞表面标志物CD133和CD117 / STRO-1；干细胞相关基因的表达量；皮下注射对裸鼠的致瘤潜力等多个方面数据证明MG63 / DXR具有OSC的特性。
图1 MG63 / DXR具有OSC的特性
2.OSC中mRNA上m6A甲基化修饰的整体概况
作者首先挑选了四个与m6A甲基化相关的主要酶，包括METTL3、METTL14、FTO和ALKBH5，从RNA和蛋白水平检测了它们在MG63 / DXR和MG63中的表达，发现METTL3和ALKBH5在MG63 / DXR中显著性上调。因此推测在OSC和非OSC细胞系之间可能存在m6A甲基化的差异，于是后期通过m6A MeRIP-seq（云序生物提供此项服务）进行进一步检测。
图2 m6A甲基化相关酶的表达
作者对MeRIP-seq（云序生物提供此项服务）得到的甲基化数据进行了进一步分析。与MG63相比，在MG63 / DXR中发现了2372个明显上调的m6A峰和3229个明显下调的m6A峰，且这些差异甲基化修饰的转录本在所有染色体上都有分布，尤其是chr1上，分布最多。通过转录本上m6A峰的密度图探究m6A在转录本中的分布情况，发现m6A峰主要富集于CDS区，终止密码子和3’UTR区。为了确定鉴定出的m6A峰是否具有保守序列，作者又进行了motif分析，富集分析结果显示m6A具有RRACH（R代表嘌呤，A是m6A，H是非鸟嘌呤碱基）保守序列，与前人的研究一致，表明测序结果的真实性。随后作者又挑选了一个甲基化差异显著的基因KLF4，对其进行了可视化的展示。
图3 OSC中m6A甲基化修饰的整体概况
3.差异m6A甲基化的mRNA的功能富集分析
为了揭示MG63 / DXR中m6A甲基化的生物学意义，将含有差异甲基化位点的基因进行GO富集和KEGG通路分析。GO分析发现，MG63 / DXR中的高甲基化基因主要富集在细胞大分子代谢过程（GO:BP）、细胞内（GO:CC）、核酸结合（GO:MF）的条目。低甲基化的基因主要富集在核碱基的化合物代谢过程（GO:BP）、细胞内（GO:CC）、核酸结合（GO:MF）的条目。值得注意的是，KEGG通路分析表明，高甲基化基因和低甲基化基因均富集到参与调节干细胞全能性的信号通路。上述分析结果表明m6A甲基化修饰可能对OSC细胞全能性有重要影响，主要通过Wnt和Notch信号通路发挥作用。
图4 差异甲基化位点的GO和KEGG分析
4. 差异表达和差异甲基化RNA的联合分析
为了了解m6A甲基化修饰与RNA表达间的关系，作者又进行了RNA-seq（云序生物提供此项服务），并将RNA-seq和MeRIP-seq数据进行了联合分析。
RNA-seq（云序生物提供此项服务）用于检测MG63和MG63 / DXR之间的差异表达的mRNA，如图5A所示。与MG63相比，MG63 / DXR中差异表达了10,350个基因，其中7602个基因下调，2748个基因上调。接着作者将这些差异表达基因与差异甲基化的基因同时分析，所有基因主要分为四类，包括263个甲基化和基因表达都升高的基因，324个甲基化和基因表达都降低的基因，61个甲基化程度高但基因表达下调的基因和16个甲基化程度低但基因表达上调的基因。作者进一步选择了富集在与干细胞全能性相关的信号通路中且甲基化和基因表达同步改变的差异基因，最后选定26个基因，包括MG63中18上调基因和MG63 / DXR中8个上调基因进行了聚类分析。同时对它们进行了GO分析，以揭示与它们相关的生物学过程。MG63中上调的基因主要参与调控成骨细胞分化并负调控细胞增殖，而MG63 / DXR中被上调的基因主要通过经典的Wnt信号通路参与正调控细胞周期和维持干细胞种群。
图5 差异甲基化和差异表达RNA的联合分析
5. 甲基化和基因表达同步改变的RNA与客户临床信息相关性分析
作者筛选出的26个基因中，在已知数据库中分析发现，FZD8和KLF4在肿瘤起始细胞（TIC）中高表达，
BMP2和SMAD5在非肿瘤起始细胞（non-TICs）中低表达，将这四个基因以及前期发现的OSC中差异表达的甲基化酶METTL3和ALKBH5，这六个基因作为研究的候选基因。探究这六个候选基因的表达与OS患者的无转移生存期的相关性，从而确认这些候选基因的临床意义。结果发现，METTL3、ALKBH5、FZD8和KLF4的高表达与OS患者的生存期正相关，BMP2和SMAD5的低表达与OS患者的生存期正相关。
图6 候选基因表达与患者生存期相关性
总结
RNA甲基化是目前科研工作者竞相追逐的热点，本文作者的研究方式非常典型的呈现了目前甲基化谱研究的主流方法----通过m6A MeRIP-seq和RNA-seq（云序生物提供以上服务）两种测序方式，将表观转录组学和转录组学两个组学进行联合分析，从而探究疾病的甲基化谱。这种方法简单快捷高效，基本3-6个月一篇甲基化表达谱的文章就基本成型，且多组学联合分析，文章内容丰富，可呈现的信息多样，是目前甲基化谱学研究的一大利器，受到众多科研工作者的追捧。甲基化修饰种类众多，除了今天介绍的m6A之外，还有m5C、m1A、m7G测序，还包括m3C测序、ac4C RNA乙酰化测序、2'-O-甲基化测序等众多修饰，这么多的选择，总有一款适合您。
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