DNA损伤的三种分子生物检测方法

DNA是携带生物体遗传信息的重要分子，它的完整性对细胞存活至关重要。然而，在生命活动中，DNA时刻遭受着内源性（氧化自由基、复制叉崩塌等）或外源性（电离辐射、烷化剂等）刺激，DNA损伤不可避免。

检测DNA损伤的方法有很多，根据其原理大致可以分为3类： 基于损伤DNA理化性质的改变检测DNA损伤、基于分子杂交检测DNA损伤以及基于DNA损伤后形成的产物检测DNA损伤。前两种方法是基于荧光标记直接观测DNA的损伤情况，而基于DNA损伤后形成的产物检测DNA损伤是通过标记物的检测间接反映DNA的损伤程度。

※ 基于DNA损伤后形成产物进行检测

DNA损伤过程中可形成某些特定的损伤产物，可通过检测损伤产物（磷酸化H2AX、8-OHdG等）来评估DNA损伤。也可标记损伤DNA，如末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL），通过标记物的检测间接反映DNA的损伤程度。

1.双链断裂标志物磷酸化H2AX检测法

H2AX是组蛋白H2A家族成员之一，包含一个进化保守区域SQ位于真核细胞的C末端，分子量为14KD，139位有个丝氨酸残基，在细胞发生DNA双链断裂后的数分钟内，将会被ATM,ATR和PRKDC磷酸化，形成γH2AX，进而迅速招募DNA修复蛋白和凋亡蛋白到损伤部位，每个双链的断裂区会有成百上千的γ-H2AX，然后在1h左右数量和密度达到峰值。由于γH2AX的出现与DNA双链断裂紧密关联，是目前国内外研究细胞DNA双链断裂应激反应的热点之一，同时也可以作为DNA双链断裂的标志物。

由于与DNA双链断裂紧密相关，γH2AX可以作为双链修复的标志物

H2AX&γH2AX相关抗体：

2.氧化损伤标志物8-OHdG检测法

DNA氧化损伤产物中，作为DNA中脱氧鸟苷（dG）的羟基加合物，8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）因其形成量大，影响因素少，已被公认为最能反映体内DNA氧化损伤程度的生物标志物。

3.DNA断片标记法

原位末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）是一种检测凋亡细胞DNA链断裂片段的方法。细胞凋亡发生时，内源性核酸内切酶将DNA降解成片段，在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下，底物dUTP 或BrDU(无或有荧光标记)可连接到DNA断片的3-OH末端，采用荧光显微镜或流式细胞仪对标记物进行分析，实现在单细胞水平检测凋亡细胞的DNA碎片。