IF:16.588|Laminins在细胞分化中的作用

近日，来自杜克-新加坡国立大学医学院的科学家在Trends in Cell Βiology（Impact Factor: 16.588）上发表了一篇综述文章，报道了细胞外基质层粘连蛋白（Laminins, LNs）在干细胞分化中的重要作用及最新应用进展。

1.Laminin和干细胞微环境

细胞内转录因子是干细胞分化的重要调节因子，但细胞外成分如生长因子、激素和细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）蛋白也在分化过程中起重要作用（图1）。然而，从组织中分离纯化ECM蛋白质难度极高，这阻碍了对ECM蛋白质的生物学功能以及对细胞分化机制影响的研究。

▲图1.多能性胚胎干细胞(ESCs)分化为三个生殖层和一些特殊细胞类型。

Laminin是一类细胞外基膜（Basement membrane, ΒM）蛋白，大约5亿年前，当单个细胞开始聚集并形成多细胞生物时，它就出现在多细胞生物中。ECM需要将细胞结合在一起，并提供增殖，分化和生长的环境。Laminin及其后的IV型胶原蛋白是最早出现的细胞外蛋白。Laminin最初是从小鼠肉瘤样肿瘤中分离得到的三聚体蛋白LN111。Laminin为异构三聚体，共有5种α链，4种β链和3种γ链，在基因上不同。理论上，Laminin链可以形成超过60种组合，但迄今为止，哺乳动物中只发现了16种不同的三聚体组合。

▲图2. 不同的Laminin亚型

Laminin影响细胞粘附、迁移、表型维持、细胞存活和细胞分化。对Laminin功能的认识主要来自于对基因突变或基因敲除小鼠引起的疾病的研究，以及对EHS小鼠肿瘤来源LN111，或者是从培养的角质形成细胞中分离的LN332的研究。目前，大多数已知的Laminin亚型都可以重组蛋白形式获得。因此，对其生物学功能的研究越来越多，它们的重要性也逐渐被发现。其中，LN511和LN521是普遍存在的BM蛋白成分，它们通过α6β1整联蛋白和PI3K/Akt途径支持PSC的培养和扩增。其余的Laminin，具有细胞类型特异性和功能，在分化方案开发中具有重要作用。

▲表1. Laminin亚型及存在组织、作用和以及缺陷造成的影响

在体内干细胞微环境（Stem Cell Niches）中，细胞位于其他hESCs或与ECM蛋白相互作用的体细胞附近，后者也可以支持细胞表型。

Laminin影响干细胞和其他细胞的机制非常复杂，但它们涉及到与相邻细胞质膜蛋白的相互作用。基于Laminin的干细胞培养分化方案，化学成分确定，无异源成分，在单细胞培养时不需要抗凋亡ROCK抑制剂，也无需经过胚状体或类器官，能够实现细胞大规模生产以及具有高度可重复性。从再生医学中产生干细胞来源的细胞用于细胞治疗的角度来看，这些尤其重要。

2.中胚层谱系分化

①心肌细胞分化

研究显示LN221亚型在小鼠心脏发育过程中表达最高，其次是LN211（图3）。LN221可用来将hESCs分化为心血管系统。这种Laminin对肌肉的发育和功能至关重要，其基因的失活导致了人类的先天性肌营养不良症，以及基因敲除小鼠的骨骼和心肌畸形和功能丧失。使用重组人源LN211和LN221可在成分确定和无异源动物条件下诱导分化出心肌细胞（Cardiomyocyte, CMs）。也有团队利用重组表达的LN521及LN221，将hESCs分化为心血管祖细胞（Cardio Vascular Progenitors, CVPs），并移植到小鼠体内，产生人源心肌束从而改善梗死心脏功能。

▲图3. 层粘连蛋白亚型在小鼠（m）ESCs和小鼠心脏发育过程中的表达（Ref 2）

②内皮细胞分化

内皮细胞的主要Laminin链是α4和α5。缺乏α4链的小鼠在整个胚胎发育过程中伴有出血，以及异常的微血管形成和成熟，证明这种特异性Laminin链在成年期内皮细胞发育和维持过程中的关键作用。LN411片段（LN411-E8）已被用于产生高功能内皮细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）。使用干细胞微环境LN521和LN511，也可以将hESCs分化为为EPCs，这些EPCs可用作筛选Zika病毒减毒性活疫苗的安全有效平台。
3.外胚层谱系分化

①皮肤表皮角质形成细胞

在上皮下皮肤组织中，主要的Laminin亚型是LN332，LN311和LN321，还有LN511和LN521。LN332是表皮-真皮连接的重要调节因子，因为它将角质形成细胞基底表面的角质形成细胞整联蛋白α6β4与基质中的VII型胶原连接起来。α5链Laminin LN511已被证明是毛发发育的重要决定因素，也是人表皮角质形成细胞的强有力的粘附分子，整合素α3β1是LN511的主要受体。皮肤BM中的Laminin，LN511和LN521，支持人表皮角质形成细胞的存活和生长，证明具有生物相关性的Laminin可以促进人表皮角质形成细胞在完全无异源且成分明确的培养系统中扩增。此外，LN411和LN421也可以支持角质形成细胞的贴壁和生长。这些发现为治疗轻度烧伤和慢性糖尿病创面等皮肤缺损提供了一个更安全、完整的人类角质形成细胞的培养体系。

②用于视网膜和神经退行性疾病的神经外胚层来源细胞

神经外胚层来源的细胞谱系，主要通过来自成纤维细胞生长因子（FGF）、骨形态发生蛋白（ΒMP）、Wnt和激活素/结节的生长因子信号通路产生视网膜RPE细胞和光感受器。对这些信号通路的理解已成功地应用于以干细胞为基础的治疗帕金森病和年龄相关性黄斑变性（ΑMD）的研究。

在神经分化培养基中，hPSCs附着在LN511和LN521上，但不附着在LN111上，促进了胚胎干细胞向中脑祖细胞的分化。多巴胺能（Dopamine，DΑ）神经元细胞在LN111上的产量比最初的研究级分化方案提高了40倍。这种方法已经被EMΑ批准用于生产GMP级hESCs用于治疗帕金森病。

目前成功促进RPE分化的方案通常是含异源动物成分，成分不明确，例如在含有明胶、胶原、Matrigel和血清的异源动物材料上进行RPE分化。而最近使用人源LN521分化RPE的方法，成功做到了无异源动物成分。目前在不同的眼球层中发现了七个Laminin亚型， LN511，LN521，LN111，LN121以及LN523，都存在于RPE层下方的Βruch膜层中。LN332，LN323和LN523出现在感光层周围的基质中。感光区人源重组LN523已被用于建立感光环境模型，全长重组人LN511可以体外扩增人角膜缘上皮祖细胞。人重组Laminin LN332促进hiPSCs向角膜上皮细胞分化。此外，全长重组LN521支持hESCs向角膜缘上皮干细胞的分化。

4.内胚层谱系分化

①胰岛细胞

对非人类灵长类动物胰岛中不同Laminin亚型的筛选证实，胰岛中可能存在LN521、LN511、LN421和LN411。这些Laminin亚型是小鼠和人胰岛体外扩张和增殖的重要包被基质。

相关的人源重组Laminin（如LN521和LN411）已成功应用于原代胰岛细胞培养系统，今后的工作将探讨它们在支持hPSCs产生功能性胰腺祖细胞方面的潜力。鉴于胰岛的结构复杂，因此必须考虑将多个胰岛细胞类型整合到成分限定的3D结构中以及它们与支持微环境的相互作用。

②肝细胞分化

在人类胎儿肝脏中，主要的层粘连蛋白链除了存在于血管BM中的α4链，是α1、α3、α5、β1、β2和γ1。已有报道，LN521和LN521:LN111的组合（1:3的比例）可以促进hPSC分化为肝细胞样细胞（Hepatocyte-like Cells，hLCs），hLCs具有成熟肝细胞特征和基因表达谱。在另一项研究中，LN511:LN111（1:3）可以支持hPSCs分化为肝母细胞样细胞（Hepatoblast-like Cells）。经长期培养，这些肝母细胞样细胞能够在LN111单独作用下维持其自我更新能力，并有可能进一步分化为hLCs和胆管细胞样细胞。综上所述，上述化学成分明确和无异源系统的有希望为未来治疗慢性肝损伤的临床应用提供新的方案。

▲图4. Laminin亚型在器官发生过程中主要表达的单向发育表达谱

总结

Laminin真的是小身材大作用，既能促进hPSCs的克隆形成及扩增，又能支持干细胞分化为多种细胞类型，Laminin支持的分化方案重复性高，可建立化学成分确定，无异源动物成分体系，这是制备治疗性干细胞来源细胞的前提。