近年来，过继细胞免疫治疗（adoptive cell transfer，ACT）取得了重大的发展，成为继手术和放化疗等常规肿瘤治疗手段外新兴的治疗方法。嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）治疗是ACT中最具应用前景的治疗方法之一1。
目前，靶向CD19的CAR-T在治疗血液系统恶性肿瘤时疗效显著，而且已有两款产品于2017年经FDA批准上市2，3。然而，虽经多番尝试，靶向其他多种肿瘤相关抗原（tumor associated antigens，TAA）的CAR-T对于实体瘤的治疗效果却仍欠佳4。
近日，中国科学院动物研究所王皓毅课题组在 JCI insight 杂志上发表题为：TGFβ inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR-T cells against solid tumors 的研究论文。
该研究利用CRISPR/Cas9技术将CAR-T表面的TGFβ受体2（TGFBR2）基因进行编辑，并在多种实体瘤模型小鼠中证实TGFBR2编辑的CAR-T在TGFβ富集的环境中具有更强更持久的肿瘤清除能力。
TGFBR2编辑的CAR-T具有更强的肿瘤清除能力
CAR-T细胞在浸润至实体肿瘤组织后所面临的抑制性肿瘤微环境（TME）是CAR-T疗法对于实体瘤的治疗效果欠佳的主要的原因之一。实体瘤由高度异质性的肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞等多种类型细胞和大量的细胞外基质组成。在这复杂的TME中，CAR-T的存活、增殖和活化等功能都被多种免疫抑制细胞和因子所影响5。
转化生长因子β（TGFβ）是TME中最重要的调控因子之一，其可由多种基质细胞如肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、血管内皮细胞（BECs）、间充质干细胞（MSCs）等所分泌。TGFβ可通过多种直接或间接的机制负向调节T细胞的功能，从而降低机体的抗肿瘤免疫能力和肿瘤免疫监视能力6，7。
基于此，王皓毅带领的研究团队利用CRISPR/Cas9技术将CAR-T表面的TGFβ受体2（TGFBR2）基因进行编辑，阻断TGFβ信号通路，然后在肿瘤细胞系成瘤（CDX）模型小鼠中瘤内注射CAR-T细胞，观察到注射后42天，TGFBR2编辑的CAR-T（M28z-TKO）即可将肿瘤完全清除，而未编辑的CAR-T（M28z）只能将肿瘤生长控制在相对较慢的速度。通过对小鼠外周血进行分析，发现M28z-TKO之所以具有更强的肿瘤清除能力源于其有更好的增殖能力以及有更高比例的记忆细胞。
▲ 瘤内注射CAR-T后肿瘤体积的监测
考虑到无创性的静脉输注方式在临床使用中更为普遍便捷，研究人员进一步观察了在相同的模型小鼠中静脉注射M28z-TKO是否仍能将肿瘤有效清除。相对于瘤内注射M28z-TKO能完全清除肿瘤，静脉注射只能基本控制肿瘤的生长。然而，相对于M28z注射后逐渐失控的肿瘤生长，M28z-TKO在静脉注射后能更有效地浸润至肿瘤组织，并在肿瘤组织中更好地增殖和发挥杀伤功能，这极有可能是其清瘤效果明显改善的主要原因。
▲ TGFBR2敲除改善了静脉注射的CAR-T在CDX模型小鼠体内的肿瘤清除效果（A）瘤内注射CAR-T后肿瘤体积的监测；（B）CDX组织中CAR-T浸润情况检测；（C）CDX组织中MKI67阳性CAR-T检测；（D）CDX组织中IFNG阳性CAR-T检测。i.v.，静脉注射。
TGFBR2编辑的CAR-T在胰腺癌模型中展现优异的数据
考虑到临床肿瘤组织异质性更高及病理类型多样，文章作者又在2例胰腺癌病人肿瘤标本构建的实体瘤（PDX）模型中进一步验证了M28z-TKO的功能优势。
其中，PDX #1组织结构疏松，靶向抗原间皮素表达丰度高且均一，TGFβ亦有明显表达。无论是瘤内或静脉注射，M28z-TKO都能在注射后21天左右将肿瘤全部清除。注射后第42天，小鼠外周血分析可见人CD3阳性细胞比例在M28z-TKO注射组亦明显升高。
值得一提的是，在肿瘤全部清除的小鼠体内进行二次接种后，新接种的瘤体再次被全部清除，而且小鼠外周血中人CD3阳性细胞绝大部分都是记忆性T细胞。
虽然PDX #2组织结构致密且靶向抗原表达异质性高，但是瘤内注射M28z-TKO仍能将初次和二次接种的瘤体有效清除。这些体内数据充分证实了TGFβ信号通路的阻断能极大改善CAR-T清除实体瘤的能力。
阻断TGFβ信号通路增强CAR-T疗效的可能机制
此外，文章作者也对TGFBR2敲除CAR-T功能得以明显改善的潜在机制做了详细探讨。RNAseq数据显示在CAR-T与肿瘤细胞共孵育体系中外源添加TGFβ1，CAR-T的细胞毒性相关基因如GZMA、GZMB，细胞因子相关基因如IFNG、IL2，以及细胞增殖相关基因如IL2RA的表达水平明显下调；而调节性T细胞（Treg）相关基因如FOXP3，以及耗竭相关基因如PDCD1的表达明显上调；TGFBR2敲除则使CAR-T免受TGFβ1的影响。
▲ 利用CRISPR技术阻断TGFβ信号通路使得CAR-T清除实体瘤能力极大改善的可能机制
进一步的体外实验也证明TGFβ可通过如上所述机制调节CAR-T功能，而利用CRISPR技术将该通路阻断可极大改善CAR-T的体内外功能。
总的看来，此篇文章利用CRISPR技术将CAR-T的内源性TGFBR2进行编辑，极大改善了其在TGFβ富集环境中的功能。这一方法为增强CAR-T实体瘤清除能力提供了新的策略，也为众多的实体瘤患者带来了新的希望。
参考论文：
1. Lim, W.A., and June, C.H. 2017. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell 168:724-740.
2. Schuster, S.J., et al. 2017. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. N Engl J Med 377:2545-2554.
3. Neelapu, S.S., et al. 2017. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. N Engl J Med 377:2531-2544.
4. Johnson, L.A., and June, C.H. 2017. Driving gene-engineered T cell immunotherapy of cancer. Cell Res 27:38-58.
5. Immunological hallmarks of stromal cells in the tumour microenvironment. Nat Rev Immunol 15:669-682.
6. Yang, L., et al. 2010. TGF-beta and immune cells: an important regulatory axis in the tumor microenvironment and progression. Trends Immunol 31:220-227.
7. Dahmani, A., and Delisle, J.S. 2018. TGF-beta in T Cell Biology: Implications for Cancer Immunotherapy. Cancers (Basel) 10.
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