HPLC法测定蛋糕中丙酸钙含量的不确定度评定

2020.2.25

王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

测量不确定度是与测量结果相联系的参数。采用HPLC法测定了焙烤类食品(蛋糕)中丙酸钙的含量，并对其相对扩展不确定度进行了评定。

　　丙酸钙作为防腐剂可以添加在焙烤类食品中，限量为2.5g/kg(以丙酸计)。高效液相色谱法(HPLC)是测定食品中丙酸钙的国家标准方法。测量不确定度是与测量结果相联系的参数，用于表征合理地赋予被测量之值的分散性。当测量结果处于临界值时食品检验机构必须进行测量不确定度评定。本文对HPLC法测定焙烤类食品(蛋糕)中丙酸钙含量的不确定度因素进行了评定，计算出不确定度并报告了结果。

　　仪器、试剂

　　仪器

　　1)高效液相色谱仪，岛津LC-20AT附紫外检测器和自动进样器;

　　2)高速冷冻离心机，北京雷勃尔LR10-2.4A;

　　3)超声波清洗器，昆山市超声仪器KQ-100);

　　4)高速组织捣碎机，上海精科DS-1;

　　5)pH计,上海仪电科学PHS-3C;

　　6)电子天平，上海上天FA2004;

　　7)溶剂过滤器及0.45μm微孔滤膜。

　　试剂

　　分析纯磷酸(H3PO4)、分析纯磷酸氢二铵[(NH4)2HPO4]

　　实验室用超纯水

　　食品添加剂丙酸钙纯度标准物质GBW(E)100078

　　色谱分析条件

　　色谱柱：

　　Agilent ZORBAX SB-Aq 4.6×250mm，5μm，P.N.880975-914;

　　流动相:

　　1.5g/L磷酸氢二铵溶液，用1mol/L 磷酸溶液调pH为3.0(使用时配制);经0.45μm微孔滤膜过滤;

　　流速:

　　1.0mL/min;

　　柱温:25℃;

　　进样量:10μL;

　　紫外检测器波长:214nm;

　　样品处理与测试

　　依据国家标准GB 5009.120-2016进行试验;

　　样品制备：

　　样品经组织捣碎机捣碎混匀后备用;

　　试样处理：

　　准确称取由组织捣碎机混匀后的样品5g(精确至0.0001g)试样至100mL烧杯中,加水20mL,加入1mol/L磷酸溶液0.5mL，混匀，经超声浸提10min后，用1mol/L磷酸溶液调pH为3左右,转移试样至50mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。将试样全部转移至50mL具塞塑料离心管中,以不低于4000r/min离心10min,取上清液,经0.45μm微孔滤膜过滤后,待液相色谱测定。

　　标准溶液的配制及标准曲线的绘制：

　　1.丙酸标准贮备液(10mg/mL)：

　　精确称取0.3146g丙酸钙标准品于25mL容量瓶中，加水至刻度;

　　2.标准曲线的绘制：

　　准确吸取5.0mL标准储备液于50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，配制成浓度为1.0mg/mL标准工作液。再准确吸取标准工作液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL至10mL容量瓶中，分别加入1mol/L磷酸0.2mL，用水定容至10mL，混匀。其丙酸标准溶液的最终浓度分别为0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL，经0.45μm 微孔滤膜过滤，浓度由低到高进样分析，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

　　测量数学模型

　　样品中丙酸钙含量(以丙酸计)，按下式计算:

　式中:

　　X—样品中丙酸钙的含量(以丙酸计),单位为克每千克(g/kg);

　　c—由标准曲线得出的样液中丙酸的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL);

　　V—样液最后定容体积,单位为毫升(mL);

　　m—样品质量，单位为克(g);

　　f—稀释倍数。

　　试样中测得的丙酸含量乘以换算系数1.2569，即得，丙酸钙含量。

　　计算结果保留三位有效数字。

　　根据数学模型分析，影响不确定度来源有以下几方面

　　1样品称量引入的不确定度,2样品定容引入的不确定度,3样品平行测定引入的不确定度,4标准系列溶液引入的不确定度,5标准曲线拟合引入的不确定度。

　　不确定度评定

　　样品称量引入的不确定度(B类不确定度)

本试验所用电子天平为万分之一，最小分度值为0.1mg，由校正证书查得天平重复性标准差0.3mg，天平重复性标准差应计算为2次。则u(m1)==0.00043(g),称样量为5.0026g，相对不确定度为：Urel(m1)=u(m1)/m=0.00043/5.0026=8.6*10^-5;

　　样品定容体积引入的不确定度(B类不确定度)

1. 20℃时50mL，A级容量瓶的允许误差为±0.05mL，按均匀分布计算，由此，带来的不确定度为u=0.05/=0.0289mL; 2.50mL、A级容量瓶重复充液2次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，由极差系数C及自由度υ,则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3*10^-2mL;

3.试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1*10^-4，温差变化引起体积的变化为：50*2*2.1*10^-4=0.021mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为：0.021/=0.0121mL。则样品定容引入的相对不确定度Urel(v1)=/50=6.8*10^-4

　　样品平行测定引入的不确定度(A类不确定度)

试验中对同一样品丙酸钙的含量进行了3次平行测定其结果分别为：1.08g/kg、1.07g/kg、1.10g/kg，平均值=1.08g/kg，标准偏差==0.0158g/kg，按均匀分布计算，其不确定度为UA=0.0158/=0.0091g/kg，则相对不确定度为Urel(A)=UA/=0.0091/1.08=8.4*10^-3;

　　标准系列溶液引入的不确定度(B类不确定度)

　　1.标准储备液引入的不确定度

①丙酸钙标准品的纯度，证书上给出的纯度99.7%，不确定度为0.6%，则标准物质引入的不确定度0.006/=0.0035; ②本试验所用电子天平为万分之一，最小分度值为0.1mg，由校正证书查得天平重复性标准差0.3mg，天平重复性标准差应计算为2次。则u(m2)==0.00043(g),称标准品为0.3146g，则由称量引入的相对不确定度为：0.00043/0.3146=0.0014;

　　③标准物质稀释引入的不确定度

(1)20℃时25mLA级容量瓶的允许误差为±0.03mL，按均匀分布计算，由此，带来的不确定度为0.03/=0.0173mL; (2)25mL，A级容量瓶重复充液2次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，由极差系数C及自由度υ，则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3*10^-2mL; (3)试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1*10-4，温差变化引起体积的变化为：25*2*2.1*10^-4=0.0105mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为： 0.0105/=0.0061mL。

　　则标准储备液由稀释引入的相对不确定度：

Urel(v2)=/25=0.0009，

　　由此，丙酸钙标准储备液引入的不确定度为：

Urel(标储)==0.0039;

　　2.标准系列溶液由稀释引入的不确定度

　　①由5mLA级单标移液管引起的相对不确定度来自三个分量

(1)5mLA级单标移液管引的容量误差查证书为±0.015mL，按均匀分布，不确定度为0.015/=8.7*10^-3(mL);

　　(2)5mLA级单标移液管的充液重复性引起的不确定度，重复充液两次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，由极差系数C及自由度υ，则由充液引入的不确定度为：0.015/1.13=0.013mL(mL);

(3)试验温度变化为±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1*10^-4，按均匀分布，由温度变化引入的不确定度为2.1*10^-4*5*2/=0.0012(mL)：则5mL，A级单标移液管体积引入的不确定度为=0.016(mL)

　　由此，5mL，A级单标移液管体积引入的相对不确定度为0.016/5.00=0.0032

　　②标液定容体积引入的不确定度

　　(1)50mLA级容量瓶体积引入的相对不确定度

20℃时50mLA级容量瓶的允许误差为±0.05mL，按均匀分布计算，由此，带来的不确定度为：0.05/=0.0289mL; 50mL，A级容量瓶重复充液2次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3*10^-2mL; 试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1*10^-4，温差变化引起体积的变化为：50*2*2.1*10^-4=0.021mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为： 0.021/=0.0121mL。由此，50mL，A级容量瓶体积引入的相对不确定度为：Urel(v2)=/50=6.8*10^-4

　　(2)10mLA级容量瓶体积引入的相对不确定度

20℃时10mL，A级容量瓶的允许误差为±0.02mL，按均匀分布计算，由此，带来的不确定度为：0.02/=0.0115mL; 10mLA级容量瓶重复充液2次，用极差计算，其极差为R=0.015mL，由极差系数C及自由度υ，则充液带来的不确定度为0.015/1.13=1.3*10^-2mL; 试验温度为20±2℃，水的体积在20℃膨胀系数为2.1*10^-4，温差变化引起体积的变化为：10*2*2.1*10^-4=0.0042mL，按均匀分布计算，温度变化引起的不确定度为： 0.0042/=0.0024mL。