新年伊始,新型冠状病毒在全国蔓延,全国大部分省份启动了重大突发公共卫生事件一级响应,很多小区都采取了封闭式管理。2月11日,世界卫生组织(WHO)将新冠肺炎命名为2019冠状病毒病,英文名为Corona Virus Disease 2019(COVID-19)。新冠病毒与2003年肆虐全球的SARS病毒,以及2012年在沙特发现的MERS病毒,均为冠状病毒属中的一种。冠状病毒基因组为一条完整的单股正链RNA,长约30kb,是RNA病毒中最长的RNA核酸链。目前主流的新冠病毒检测手段为实时荧光定量PCR和基因测序。使用普通PCR和基于MALDI-TOF的单核苷酸多态性SNP分型技术,也可以实现病毒的高通量检测:病毒的RNA经逆转录生成cDNA,PCR扩增,再进行单碱基延伸,点样到芯片靶板,最后到MALDI-TOF仪器检测分析。岛津公司与合作方毅新博创公司正在进行RNA病毒SNP分型的研发,预计能实现12种RNA病毒的检测。本文先分享岛津台式MALDI-8020仪器在核酸类药物快速检测的方案。
台式MALDI-8020外观
核酸类药物分析
由遗传信息的载体DNA和RNA等核酸类物质组成的药物称为“核酸类药物”。核酸类药物可以将传统低分子药物和抗体药物无法靶向的mRNA(messenger RNA)和microRNA作为靶标,有望成为治疗至今仍难以治愈的遗传性疾病等的新一代创新药物。核酸类药物无需像抗体药物一样通过细胞培养来合成,可以通过化学合成,生成分子量从几千到几万不等。确认合成的核酸类药物是否具有预定的核苷酸序列,对确保药物的功能至关重要。
本文测试了序列为5’-CTGAGACACTGAAGGTAGGA-3’的合成核酸。将浓度为100pmol/μL的1μL样品溶液点在MALDI靶板上,其上再点上基质溶液(0.5μL),干燥后测定,一级质谱图如图1。同时利用源内裂解技术(ISD: In source decay)测定样品,结果如图2所示,获得合成核酸的ISD谱图。
图1 合成核酸的MALDI-TOF质谱图
测定模式:Linear Positive
图2 合成核酸的MALDI-ISD-TOF质谱图和裂解离子
测定模式:Linear Positive
肽核酸检测
肽核酸(PNA)是模拟DNA的人工合成聚合体,DNA的核酸碱基(A/G/C/T)没有改变,只是用肽结构取代了主链的脱氧核糖和磷酸基团的部位(图4)。主链的结构,n-(2-aminoethyl) glycyl单元是由一个酰胺结合的,带有中性电荷以及光惰性的,不同于带负电荷糖磷酸为主链的DNA。由于电荷状态的不同,PNA强烈地结合到互补的DNA/RNA序列。与DNA相比,PNA的重要作用在于具有较强的结合力以及杂交特性。因此,PNA在分子诊断和研究领域中广泛被应用,比如,单核苷酸多态性(SNP)检测,荧光原位杂交(FISH)和分子生物传感器等技术。PNA也有可能作为反义药物(anti-sense drugs)应用于治疗人体免疫缺陷病毒。
图3 PNA和DNA的主链结构比较
图4 台式MALDI-TOF MS应用于PNA分析
样品A(2pmol,基质CHCA)的分析结果表明,在线性模式下也能检测到>8000 FWHM的高分辨率。样品B/样品C(5.5pmol/7.5pmol,基质SA)的高分子量区域的分析结果用平均分子量标记。
MALDI-TOF因其简单的前处理方法和准确的分子量信息获得好评。台式MALDI-8020能在核酸类药物及肽核酸的研究开发及品质管理中起到重要作用。MALDI-8020是世界上最小的线性MALDI-TOF MS,可满足线性模式下蛋白质、核酸、小分子药物等的分析需求,并有望在生物化学和分子生物学中广泛应用。期待MALDI-8020今后能在冠状病毒的SNP分型中有良好表现。
没有一个冬天不可逾越,
没有一个春天不会到来。
武汉加油!中国加油!