HPLC系统配合核壳型色谱柱快速分析醛酮类成分

本文采用全多孔型色谱柱与核壳型色谱柱对于14种醛酮类成分进行了对比分析。采用核壳型2.7µm/2.6µm色谱柱，比全多孔5µm色谱柱分析时间缩短了57%~71%，灵敏度提高了2.7~4.1倍。核壳型色谱柱具有压力低、柱效高、快速的特点，与RIGOL L-3000高效液相色谱系统配合可实现快速分离，不需要使用昂贵且不易维护的UPLC设备。核壳型色谱柱因所用筛板孔径要大于UPLC色谱柱，大大减少了困扰UPLC柱入口筛板的堵塞问题。根据Van Deemter方程可知，核壳型色谱柱在更高流速条件下仍能保持分离性能，本文也考察了提高流速对于核壳型色谱柱分离度的影响。

要想实现高效、高速、高灵敏度的分离，既要有超高效液相色谱系统，又要有相对应的色谱柱。核壳型色谱柱具有与亚-2µm全多孔填料颗粒色谱柱相似的高柱效，这是由于其传质距离短和粒径分布窄的原因。核壳型填料的色谱柱背压通常较低，一般为亚-2µm全多孔填料色谱柱的40~60%，这样可以在一般HPLC上进行快速分离。且核壳型色谱柱在流速较高的情况下也能保证高柱效的特点，使得在仪器压力允许范围内，可根据方法适当提高流速以更快进行分析。对于2.7µm/2.6µm核壳型填料的色谱柱，它们的入口筛板比亚-2µm全多孔填料颗粒色谱柱更大，所以对于脏样品的容忍度更高，可更方便的把应用于传统5µm填料色谱柱的方法进行转移。

美国环境保护协会颁布了监控空气中醛酮的取样和分析方法，在HJ/T 400-2007 车内挥发性有机物和醛酮类物质采样测定方法附录C中也规定了采用高效液相色谱法测试醛酮的含量。本文采用了RIGOL L-3000高效液相色谱系统配合核壳型色谱柱对14种醛酮类成分进行了分析，快速的分离节省了测试时间、测试溶剂、提高了灵敏度。

仪器与试药

仪器

RIGOL L-3000高效液相色谱仪(北京普源精电科技有限公司，包括L-3120溶剂组织器、L-3220输液泵、L-3320自动进样器、L-3500紫外可见检测器、UltraChrom工作站)，电子天平(德国塞多利斯)，超声波清洗仪(天津奥特赛恩斯)，超纯水仪(Millipore)。

试药

14种醛酮二硝基苯腙的标准品混合液;乙腈(Fisher、色谱纯)。

分析方法

色谱条件

色谱柱：见表1;

流动相：40%水-60%乙腈;

检测波长：360nm;

柱温：室温;

流速：1.0ml/min;

进样量：5µL。

表1.本实验中采用的色谱柱信息

对照品溶液制备

14种醛酮二硝基苯腙的标准品混合液(包括：甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、己醛、甲基丙烯醛、苯甲醛、甲基苯甲醛、丙酮、丁酮、环己酮、丙烯醛、丁烯醛)，采用100%乙腈稀释20倍待测。

结果与讨论

全多孔型色谱柱与核壳型色谱柱对比

在使用RIGOL L-3000高效液相色谱系统，不改变设备硬件的情况下进行该对比试验。图1显示了采用RIGOL Compass(2)C18色谱柱、A公司 C18色谱柱、P公司 C18色谱柱对14种醛酮类成分进行分析的色谱图。按分离顺序14种醛酮化合物分别为：1-甲醛、2-乙醛、3+4-丙烯醛+丙酮、5-丙醛、6-丁烯醛、7-丁酮、8-丁醛、9-甲基丙烯醛、10-苯甲醛、11-戊醛、12-甲基苯甲醛、13-环己酮、14-己醛。

• 采用全多孔型的5µm色谱柱完全洗脱14种化合物需要35min;当采用2.7µm/2.6µm的核壳型色谱柱仅分别需要15min、10min，所用的洗脱时间与溶剂分别减少了57%、71%。

• 采用全多孔型的5µm色谱柱分离时，3、4号色谱峰、7、8、9号色谱峰没有完全分离;当采用2.7µm/2.6µm的核壳型色谱柱时，7、8号色谱峰分离明显改善(分离度分别为1.00、0.83)，9号色谱峰基本实现基线分离(分离度分别为1.46、1.44)。

• 采用全多孔型的5µm色谱柱，各色谱峰展宽相对较大，峰高不高。而核壳型色谱柱具有更短的扩散路径，从而降低了溶剂的轴向扩散并使峰展宽效应最小化，当采用2.7µm/2.6µm的核壳型色谱柱进行分离时，所有色谱峰峰高均有了大幅提高(见图2)，检测灵敏度相比全多孔5µm色谱柱平均提高了2.7倍、4.1倍。

• 当采用2.7µm/2.6µm的核壳型色谱柱进行分离时，各化合物的理论塔板数也有大幅的提高(见表2)。对于已经基线分离的色谱峰，理论塔板数提高了1.2~5.9倍、1.4~6.4倍。

图1. 14种醛酮类成分洗脱的色谱图(图A：RIGOL Compass(2) C18, 4.6×250mm, 5µm色谱柱， 柱压1490psi; 图B：A公司 C18 4.6×100mm,2.7µm色谱柱，柱压2450psi;图C：P公司 C18 4.6×100 mm, 2.6µm色谱柱， 柱压2300psi)。

图2. 不同色谱柱分离14种醛酮类化合物的峰高。

表2. 不同色谱柱分离14种醛酮类化合物的理论塔板数

注：对于采用RIGOL Compass(2) C18色谱柱分离，由于7、8、9三个色谱峰没有分开，故此处采用同一个理论塔板数。

不同流速对分离度的影响

核壳型色谱柱的快速分离不仅是由于小粒径(2.7µm/2.6µm)，还与其实心硅核表面的多孔层有关。当增加流动相流速时，低的填料内部的低传质速度会限制分离性能，而核壳技术通过减少样品进出固定相的路径长度，进而减少了样品在填料内部的时间，实现了快速色谱分离。这也就意味着使用更短的柱子和更高的流速能获得明显的快速高效分离。

图3、图4显示了使用流速1.0ml/min、1.5ml/min分别在A公司 C18色谱柱、P公司 C18色谱柱上进行分离。当流速从1.0ml/min提高至1.5ml/min后，分离时间分别缩短了33%、30%;各化合物的分离度则基本保持不变(见表2)，可见采用提高流速的办法既能获得更快的分离速度又能保持分离效率。当流速增加后仪器系统压力增加(不超过4000PSI)，RIGOL L-3000液相系统(耐压9000PSI)可以满足需求，相比全多孔型的5µm色谱柱，在快速获得测试结果的同时又保证了化合物的分离度。

图3. 采用A公司 C18色谱柱对14种醛酮类成分分离的色谱图(图A：流速1ml/min，柱压2450psi;图B：流速：1.5ml/min，柱压3850psi)。

图4. 采用P公司 C18色谱柱对14种醛酮类成分分离的色谱图(图A：流速1ml/min，柱压2300psi;图B：流速：1.5ml/min，柱压3600psi)。

表2. 核壳型色谱柱在不同流速下各化合物的分离度

小结

采用核壳型的色谱柱既不用购买昂贵的的超高压液相色谱仪，又不用开发新的实验室方法。相比常规全多孔的5µm色谱柱，只需简单的方法转换就可以大大减少分离时间、减少使用试剂、提高灵敏度。相比亚-2μm色谱柱，核壳型色谱柱更耐“脏”样品(有较大孔径的入口筛板)、具有更低的系统压力。目前市场上大部分的核壳型色谱柱耐压在8700psi(600bar)及以上，为了更充分利用色谱柱高流速下仍能保持高理论塔板数的特点，建议用户选择耐压更高的HPLC设备。由于采用了较短的色谱柱，色谱峰出峰一般会较快，故方法中需要设置高的样品采集频率，以便得到更真实色谱峰峰形。