HPLC良好的连接方略

2020.3.04

王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

毛细管对高效液相色谱分离的影响

若高效液相色谱 (HPLC) 系统采用了不适当的连接方式或者应用不正确的毛细管，均可能导致均可能导致不良的峰扩宽，色谱柱的最佳分离效率就更无从谈起。甚至还可能发生使用的柱子越细，其洗脱峰的扩宽反而越大的情况。本文将详细介绍毛细管对高效液相色谱分离的影响，以及如何选择正确的毛细管与连接方式。

图1. 为了达到最佳分离性能，即使是毛细管和管路连接也必须与HPLC系统相适配。

高效液相色谱柱良好的分离效率是HPLC成功分离的一个重要前提，不适当的管路连接或毛细管的使用不当，均可能导致不良的峰扩宽，因此需要特别注意。当使用4.6×250mm的“老式”标准分离柱时, 毛细管的作用和管路连接的影响还不是很突出;而当使用2.0×100mm的细径色谱柱时，它们的影响就很大。

对于“Ex-柱”而言，造成峰扩宽的主要原因是管路连接中使用了错误的毛细管和空腔，它们会显著扩张淋洗通道。因此原则上应尽可能采用窄小的柱径，并缩短连接管路。

如果用户使用的是由同一制造商供应的配套设备或紧密装配型高效液相色谱仪，那么所有的管路连接已经由供应商预先优化了。这类设备出现问题的情况仅在于：需要联接另外一家公司的检测器时，或者需要用不同的组件来自行组装一套HPLC系统时。

通过分离柱的峰宽度是与色谱柱的尺寸成正比的，简言之：细柱产生窄峰。液体输导产生的峰扩宽则会牵涉到整个系统，因而需要逐一协调。

泊肃叶定律

法国物理学家吉恩·伦纳德·泊肃叶对血液循环系统生理学的兴趣促成了他在1840年对液体在细管中的流体行为进行基础性的实验研究。在样品和洗脱液之间不是形成一个直界面，而是层流的形式。在直径为“dt”的管子内(高效液相色谱毛细管)流体的不同流速构成一个“U”型(如图2所示)。

图2. Jean Louis Léonard Marie Poiseuilles描述的液体在细管中的流体行为。 dT=内径，U= 流速，U_MAX=最大流速，U_AVE =平均流速。

为了尽量减少峰宽，应选择尽可能小的管道直径。样品分子有一种向流体边界扩散的趋势。假如没有这个扩散，洗脱峰将是无限宽的，因为根据泊肃叶理论，流速在毛细管管壁处为零，因而样品分子在这一点上将是极其缓慢地前行。而扩散的作用导致了样品分子由管壁迁移到管子中部，因而，样品峰得以在有限的时间内洗脱，并呈现有限的峰宽。

毛细管的优化

高效液相色谱系统可以有多种不同的安装方式，那么，我们应该尽可能地缩短进样器与色谱柱之间的连接?还是色谱柱与检测器之间的连接?或者两者均可?可是这是绝对不能随意而为的。而且其应用程式还不能随意推广到任何一个高效液相色谱系统。下面的实验将清楚地演示毛细管对其的影响。

实验装置

带有10µl样品环的Rheodyne7125注射器，UV检测器设在254nm，色谱柱4.6×100mm使用的是5-μ柱材料，流速为1ml/min以及8µl样品检测池，这些都是“标准”高效液相色谱的条件。如果使用0.13 mm内径的毛细管，色谱柱和检测器之间的连接长度则对系统的影响不大。只要将毛细管的直径加倍(这里用到0.25mm)，分离效率即随连接长度的增加而显著地降低(如图3所示)。

图3. 将毛细管直径増大一倍(这里0.25mm)，分离效率随连接长度的增加急剧下降。A：0.25内径×5cm，B：0.25内径×20cm，C：0.25 内径×80cm。

小体积HPLC色谱柱

在使用细而短的色谱柱的情况下(例如 2.0×100mm，流量200µl/min),毛细管的影响甚至更具破坏性。若采用0.13mm内径的毛细管和80cm的连接长度，能观察到低于18%的峰展宽。如果使用0.25mm的毛细管，即使是5cm的短连接，分离效果已是明显差了很多，而使用更长的毛细管则分离变得完全不可用了(如图4所示)。