二维凝胶电泳实验的纯水选择

图1. （A）采用二维凝胶电泳法进行U937细胞中蛋白质提取的对比试验示意图。（B）采用Coomassie蓝显色的凝胶：（S）为采用灭菌瓶装水进行加工；（U）为采用纯水加工。（C）凝胶的三维密度扫描图像分析表明，相对于瓶装水制备的凝胶（上图），系统新制纯水制备的凝胶中出现的斑点数量更大（下图）。

通过制备凝胶进行二维凝胶电泳实验时，将灭菌的瓶装水与新制备的纯水进行了比较，结果显示，水的质量已经影响到蛋白质的分离效果。另外，应用0.22μm终端滤膜新制备的纯水，取得了更好的分离效果。

二维凝胶电泳是蛋白组学研究中最重要和最常用的技术，其分离结果会因样品制备、电泳、染色和数据处理等方面的问题受到严重影响，保证二维凝胶电泳得到准确、具有重现性结果的重要手段之一，就是应用高纯水。

瓶装水与新制纯水

实验室中纯水的来源通常是瓶装水和制水系统。装置良好的制水系统生产的水，仅含有极微量的离子（电阻为18.2 Ω·cm）和有机化合物（总有机碳TOC＜3ppb）。供水系统通过反渗透技术（RO）、电法去离子化技术（EDI）、离子交换树脂以及活性炭吸附、紫外线氧化灭菌技术生产纯水。通过取水处的终端过滤，例如超滤膜，纯水便能符合实验室的特殊应用。

本文将灭菌的瓶装水（Baxter）与新制备的纯水进行了比较。纯水通过Milli-Q系统采用内置超滤器制备，生产纯水的电阻为18.2Ω·cm，TOC＜10ppb。自来水经过Elix-System装置的RO和EDI处理为系统提供进水。

两种纯水的应用比较

为了比较两种纯水用于二维凝胶电泳时的性能，进行了带大肠杆菌提取物的二维凝胶的制备平行试验（如图1A）。一维上应用了3~10的线性pH范围；二维上的分离则在含12%的SDS(十二烷基硫酸钠)-聚丙烯酰胺的凝胶上进行。采用Coomassie蓝或银显色剂使其显色，Coomassie蓝是凝胶的普通显色剂，而银显色剂的灵敏度超过100倍，但受污染作用的影响也要严重100倍。

图2. （A）采用二维凝胶电泳法进行E-大肠杆菌中蛋白质提取的对比试验示意图。（B）为以Coomassie蓝显色的二维凝胶：（M）采用0.22μm滤膜过滤的纯水；（U）采用超滤过滤器纯水进行制备。（C）密度扫描图像分析表明：相对于采用超滤过滤器纯水而言，采用0.22μm滤膜过滤的纯水能够得到更好的分离度与更敏锐的斑点。

两种不同来源的水在一维分离中被用于重氢化溶液和平衡缓冲液和12%的SDS（十二烷基硫酸钠）-聚丙烯酰胺-凝胶的制备，在二维分离中被用于缓冲溶液和染色溶液的制备。如图1B所示，采用瓶装水制备和加工的凝胶显示出明显的条痕，可能是不完全或不适当的聚焦、蛋白质重叠、样品前处理以及蛋白质离析所致。而缓冲液和凝胶配制用水受到污染，也会导致严重条痕现象的出现，例如盐分和有机物的进入，可导致不良的聚焦，并在水平方向上形成条痕。水质的污染同样也会影响到二维方向上凝胶的不均匀或不完全聚合，从而导致在垂直方向上形成条痕。

采用纯水制备和加工的凝胶（如图1B所示，对于在本图中未有显示的银染色凝胶亦然），却显示出微小的条痕，以及明显的蛋白质斑点。在以纯水制备的凝胶上检测出407个蛋白质斑点，而采用瓶装水制备的凝胶上则仅发现了206个斑点（见图1C）。这一结果表明，水的质量已经影响到采用二维法分离蛋白质的效果。

不同终端过滤方式的比较

本研究对两种不同终端过滤方式进行了比较，分别为超滤过滤器和0.22μm滤膜过滤器。两者均由Elix-3 UV System提供进水，而由Milli-Q Advantage A10 System提供具有18.2 Ω·cm电阻和TOC ＜ 5 ppb的纯水。Milli-Q System装备两种终端过滤器，即超滤过滤器（Biopak）和0.22μm滤膜过滤器。超滤过滤器能有效地去除核酸，因而广泛地应用于生命科学实验。

图3.  预浓缩后水的HPLC谱图，绿线表示超滤过滤器得到的水，蓝线表示采用0.22 μm滤膜过滤得到的水。（A）为UV 210nm检测；（B）为ESI正离子的质谱图。

0.22μm滤膜过滤器则因能证实含量甚微的可萃取物质，在一定条件下更适用于蛋白组学分析。采用Coomassie蓝进行显色时，对于分子质量大的物质，超滤过滤器处理的纯水所制备的凝胶碱性pH介质中会出现条痕（见图2B右上方），而通过0.22μm滤膜过滤处理的水产生的斑点则更好地分布于凝胶中（见图2B）。这种相邻斑点之间更好的分离度以及对斑点的分析，通过密度扫描图像分析得到了证实（见图2C）。

采用HPLC-MS对超滤过滤器得到的纯水和0.22μm滤膜得到的纯水所产生的污染情况进行了比较。将待测水通过C18预柱进行预浓缩60min，此时有机污染物富集于预柱顶部，当进行梯度淋洗时，有机溶剂便将污染物带出柱外，这些污染物经由质谱检测器进行检测。图3显示，相对于0.22μm滤膜过滤水，采用超滤过滤器的水在UV和质谱图中出现了数量更多的杂质峰。由此可以判断，超滤过滤器可能会造成超滤水受到污染，进而影响凝胶的质量，影响蛋白质分离效果。

小结

实验数据表明，二维凝胶分离中使用的纯水，会影响蛋白质的分离效果。盐分和有机微粒带来的污染，可改变缓冲液的离子强度，从而影响蛋白质的迁移。储藏容器或管道中的污染物，可能对纯水质量产生影响，从而导致不良的分离，例如瓶装水制备凝胶时已经引起了条痕。应用具有0.22μm终端滤膜的制水系统新鲜制备的纯水，二维凝胶电泳法，能够得到良好的蛋白质分离效果。

凝胶电泳实验的纯水质量

在进行二维凝胶电泳法分析时，除了高质量的试剂外，水的质量也非常重要，甚至会对结果产生决定性影响。实际研究表明，应用新鲜制备的纯水可以得到分离效果更好的凝胶。此外，推荐采用过滤膜，其对污染杂质的滤除效果远超过普通超滤过滤器。