再水化上样是二维凝胶电泳样品导入的最简便方法，这一方法使得样品缓冲液中的蛋白质样品在 IPG 胶条吸收样品溶液时被动导入，且蛋白质可以在整个 pH 梯度中均匀分布。在一些商品化的等电聚焦仪器中，IPG 胶条的再水化和聚焦可以用相同设备仪器完成，无需人工操作。这种仪器也可以进行所谓的主动再水化，即在胶条再水化上样过程中接入低电压 (30~50V)，在一些情况下, 主动再水化可以促进样品应用，因为这促使盐离子向电极移动，去除了蛋白质中的蛋白酶，并帮助大分子进入凝胶之中。然而, 等电聚焦过程中的 IPG 胶条再水化方法 (正面朝下) 有些时候也会出现较低分辨率的情况，这是由于等电聚焦胶条的多余的机械应力加在了聚焦托盘和塑料凝胶衬底之间，蛋白质数量较多时这种情况尤为常见。在这些情况下，使用聚焦仪器，并让塑料衬底直接与聚焦托盘接触 (凝胶便会正面朝上），可利于更为复杂困难的样品（图 30.3)。
(6) 可选项：主动再水化 (在一些设备配置下可以进行）。当梯度胶条正面朝下并和电极接触时，样品的再水化即可发生。再水化过程中，电极会在胶条上产生较低（通常 30~50V) 电场。在一些情况下，主动再水化能够促使高分子质量蛋白质进人梯度胶条之中。在这种配置下，等电聚焦仪器一开始聚焦于正面朝下的梯度胶条之上，而这时并不需要人工干预。
使用碱性范围的 IPG 肢进行等电聚焦
再水化上样的一大优点便是省去了许多人工操作步骤。然而，它也有许多不足之处, 特别是在碱性 pH 范围中，因为在碱性环境中蛋白质会在胶条表面聚集, 并在二维凝胶中留下水平拖尾。
与酸性范围相比 JPG 胶条在碱性范围的电泳条件有所不同。在碱性 pH 环境下的等电聚焦过程，存在着还原剂 DTT 的水转运与迁移。为了将这些影响降到最低, 蛋白质样品通常在阳极一端进行杯上样, 而不是进行凝胶内再水化（图 30.3)。碱性胶的最大蛋白质载量低于酸性胶。强烈建议，每杯蛋白质上样不要超过 0.5 mg, 以防拖尾。
以下方法用于 pH3~11 和 pH7~11 的 24 cmIPG 胶条。
(1) 确保最终样品体积不超过上样杯容量 (通常为 100~120 ML, 具体参照制造商规定的容量 (2) 在溶胀盒中，IPG 胶条在含有羟乙基二磺化物 (HED) 的再水化缓冲液 (不含蛋白质样品）（DeStreak;01ssonetaL,2002) 中进行再水化。在这一阶段，可加人终浓度为 0.5% 的 IPG 胶条缓冲液，用以水平等电聚焦和垂直 SDS-PAGE。由于在再水化过程中无蛋白质存在，可将时间缩短至 6 h(为了让再水化和聚焦在同一天进行），但是通常推荐将这一时间持续在 12 h 以上。
(3) 在完全再水化后，将 IPG 胶条放置于水平电泳系统，并将此系统冷却块温度恒定于 20°C。
(4) 将潮湿的吸干纸铺于再水化的 IPG 胶条两端，电极放置到位。将上样杯小心放置在阳极 (即梯度的酸性一端) 正下方，这样一来，杯底便可直接和 IPG 胶条顶部接触并密合，但不会破坏凝胶。再将石蜡油覆盖于胶条之上。
(5) 确保石蜡油不会漏入杯中, 然后向杯中加入 1 0~2 0 的石蜡油，小心地用移液器在石蜡油下移取样品 (具体每杯最大样本容量应参照制造商规定的容量)③。
(6) 表 30.1 为典型的聚焦方案.
IPG 胶的平衡
等电聚焦完成后，在进行第二维电泳之前有必要先对 IPG 胶条分两个步骤进行平衡。电渗（electroendosmoticeffect) 会导致一维到二维转换的效果变差，而平衡缓冲液中含有 6mol/L 尿素和 30% 的甘油，可降低电渗的影响（Sanchezetal.,1997)。并且，平衡缓冲液中含有 2%(W/V)SDS, 使蛋白质带上负电荷以进行 SDS-PAGE。在平衡过程中及后续一维到二维的转换过程中，蛋白质的损失主要是因为蛋白质被 IPG 胶基质较强吸收以及冲洗的原因。大部分蛋白质损失都发生在平衡过程的前几分钟，而在平衡过程的第二个步骤中，蛋白质损失极少 (Sanchezetal.，1997)。
(1) 在聚焦完成之后，将石错油从 IPG 胶条上移除, 并将 IPG 胶条孵育在平衡缓冲液之中。这一步骤可以在各种容器、密封管，甚至是在平底的 IPG 胶条聚焦支持面上进行，以最大限度减少对胶条的操作。
(2) 胶条首先在 25~100 mL 的平衡缓冲液中进行平衡 (15~20 min), 缓冲液中还含有 1%~2%(m/V) 的 DDT 以减少二硫键。
(3) 将溶液倒掉, 替换成等体积含碘乙胺酰 [为 DTT 用量的 2.5 倍的平衡缓冲液，再孵育 15~20 min, 使已形成的巯基被脲甲基 (净分子质量增加 57Da) 烷基化。这样能够防止巯基在二维 SDS-PAGE 时再次氧化，从而防止蛋白质拖尾礼 (4) 这时便可将平衡后的 IPG 胶条在二维 SD&PAGE 凝胶上进行电泳，或包两层塑料膜，将其冷冻储存在一 20°C 或一 80°C 数月。对于标记 DIGE 的样本来说，以此方法储存可在至少一周内不影响 Cy 染料的性能。如有需要，可在聚焦之后，用此方法直接将 IPG 胶条冷冻，将平衡和还原/烷基化步骤留到需要二维分离时再完成。
SDS-PAGE: 第二维
在平衡过程结束之后，胶条便可用于第二维 (SDS-PAGE)。当超过一块凝胶需要进行电泳时 (在比较蛋白质组学中很常见），凝胶一起进行电泳可获得最具可重复性的结果。
通常需要使用可承载 10~12 个大规格（24 cmX20 cm)SD&~PAGE 凝胶的电泳棺, 这种电泳槽在市面上可以买到。为了提高重复性、降低电泳过程中 SDS 的损耗, 建议使用冷却系统使缓冲液保持在 20°C。
自制的凝胶使用普遍、价格适宜，但需要大量人力重复制备。现成的预制凝胶在市面上也可购得, 包括用于 DIGE 的使用弱荧光支撑介质的凝胶。不同交联剂比例（丙烯酰胺：双丙烯酰胺) 的丙烯酰胺浓缩液也可使用。对于一般用途而言，12% 均一孔径凝胶 (12%T、26%C) 能够在便于制备和分辨率上达到最好的折中效果。梯度凝胶在更广的质量范围中分离效果和分辨率更好, 但却更难大规模重复制备。重复制备梯度凝胶专用的制胶器也可在市面上买到。
人工灌制的凝胶可借助多凝胶制胶器单独制作或批量制作。每份多凝胶灌制时所需要的丙烯酰胺溶液总量可根据每块独立凝胶的设置和装备提前确定。下面是终体积为 2.3L 的多凝胶制备的一个例子。若要求更小体积, 成比例地调整用量即可。
(1) 通常，用塑料板将有 1.0 mm 或 1.5 mm 厚度带有垫片的玻璃板分开，以防止凝胶聚合作用以后玻璃板之间相互粘连。如果需要，可在凝胶灌制之前在玻璃板之间放人写字的 Whatman 滤纸，以便给每块凝胶一个唯一的连续识别号码。
(2) 在真空瓶中加入 920 mL3 0%(m,V) 丙烯酰胺-双丙烯酰胺; 容液，其中丙烯酰胺！双丙烯酰胺为 37.5:1，再加入 575 mLI.5mol/LpH8.8 的 Tris-HCl 及 770 mL 水 [见步骤 (4)]。
(3) 混合物抽气处理 10 min, 以移除微小气泡, 这些气泡在某些情况下会干扰聚合作用，并在蛋白质染色后引起点拖尾。
(4) 可选项：脱气后，可将 SDS 加人到丙烯酰胺溶液中, 终浓度为 0.01%(35 mL 水中加人 2.3 g)。然而，许多研究表明，这一阶段不需加入 SDS 也可以获得品质好的溶液，最有可能是因为携带蛋白质通过凝胶的 SDS 在平衡阶段和/或电泳缓冲液作用下已经与蛋白质结合 (并且在电泳开始阶段，电场产生时，凝胶中的任何 SDS 都会在蛋白质进人凝胶前离开凝胶）。如今许多商业渠道都会提供含有或不含 SDS 的预制凝胶。若本步骤不使用 SDS，则要在步骤 (2) 中将 770 mL 加水量替换成 805 mL[见步骤 (2)]。
(5) 在灌胶之前，要采取温和方式或用一个搅拌棒混匀，在丙烯酰胺混合物中加入 7 00 mg 过硫酸铵 (APS，现用现配) 和 300TEMED(根据不同灌胶装置，丙烯酰胺混合物用量减小时，APS 和 TEMED 的用量也应成比例地减少）。
(6) 制备多凝胶所用的槽需要从底部开始浇注，至离玻璃板顶部 2 cm 的高度即可。小心地在凝胶上覆盖 I.0~I.5 mL 缓冲液饱和的异丁醇，使聚合作用开始
(7) 在聚合作用完成之后，清理制胶玻璃板上剩余的聚丙烯酰胺残留物，用水或 SDS 电泳缓冲液覆盖，用双层塑料薄膜封盖，可在 4°C 保存几周。
(8) 若先前的第一维 IPG 胶条 (已平衡和还原/烷基化) 被冷冻过，在解封和操作这些胶条前先放置几分钟使其完全解冻。冲洗并除去第二维凝胶玻璃板顶部空间中的水或 SDS 电泳缓冲液。
(9)IPG 胶条应该浸泡在 SDS 电泳缓冲液中，随后放置在 SDS-PAGE 凝胶装配的顶部孔空间内。梯度胶条背后的塑料衬片需要黏附在其中一块玻璃板的内表面 (如果可以的话通常是较长的那块玻璃板），并且随后可以简单地用薄卡片或尺子轻触放入合适位置 (确保卡片或尺子压力是作用在塑料衬片上而不是 IPG 凝胶上）。SDS 电泳缓冲液覆盖在电泳槽内后，使用同样的轻触步骤可以轻易地移除气泡，实现 IPG 胶条与二维凝胶的良好接触。装置装配完毕后，在第二维电泳运行中不可以再移动 IPG 胶条。
(10) 可选项。为确保 IPG 胶条和凝胶良好接触，可以使用琼脂糖溶液以保持 IPG 胶条处于适合位置。琼脂糖溶液需保温在 65°C 并先被加入到凝胶顶部。随后立即将平衡后的 IPG 胶条放在凝胶上面。有些人赞成这么做, 但这确实是一个笨拙的方法, 并且若在胶条放置完毕和气泡移除前琼脂糖溶液就凝固的话，将会变得难以处理。
(11) 可选项。蛋白质分子质量标准可在旁侧进行电泳 (通过小块纸片上样）。
(12) 初期将电流设置为每块凝胶 5~10mA 以使蛋白质进入凝胶，随后设置电流为每块凝胶 20mA，l5°C 过夜直至蓝色前沿到达凝胶末端。有条件的话采用恒定功率，至少在第 Ih 要将功率设置为每块胶小于 IW，随后功率每块胶不大于 15W 直到完成，这是最优设置，因为电泳时随着盐和离子离开凝胶，电压和电流强度将会发生改变。
电泳完成之后，固定凝胶并采用各种各样的可视和荧光染色技术对凝胶染色。通过荧光成伐，DIGE 胶可在第二维电泳完成后立即成像。随后可以将凝胶放在冰箱或 4°C 冷藏间里保存几个月。经二维电泳并长时间保存后的蛋白质，采用质谱分析仪来鉴定是没有任何问题的叭。
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