生物反应的非侵入式检测

检验适宜于蛋白表达的细胞株，或者开发放大规模的生物过程，均要求最佳的培养条件，化学光学测量技术可对重要的培养参数进行非侵入式实时监测。

当实验主要是小规模培养（摇瓶、微孔板）时，采用常规测量系统监测溶解氧浓度（DO）和pH值会是一件劳神费力的事，尤其当无菌操作时需采用侵入式的测量方法（例如电极测量）。化学光学传感器可按照非侵入方式对这些培养参数进行测量，将传感器斑点预置入一次性容器内部，然后借助相应的测量仪器对透明的容器璧读取数据。将这些传感器集成于一次性容器的生产过程中，可保证其无菌性，对原料的正确选择，可保证其无毒性，采用预先对系统进行的校正则能取得最大的效益。

实时监测

PreSen 公司的化学光学传感器由薄层敏感材料组成，这种材料能对氧气、二氧化碳和pH值产生反应。测氧时传感器斑点经由一定波长的光线所激发，进而发射出荧光，如果存在相应的分析溶质分子，则从无辐射过程中释放的能量会传递到这种分子上，由此导致荧光的减弱或者熄灭。在检测pH值和二氧化碳时，采用了由不同具荧光的染料组合的所谓“双寿命参照DLR”方法。相应的数据读取仪器含有发光二极管和光电二极管，借助于塑料光纤将光导入传感器并对荧光信号读取数据。

微孔板常被用于提高实验通量和降低样品体积。PreSens公司的一次性传感器-微孔板能够实时监测氧气和pH值，而不会使培养遭遇风险污染。在含有24孔或6孔的多碟中的底部分别置入用于测氧的传感器（氧碟）或者用于测定pH值的传感器（水碟）。微孔板中加入样品，准确放进传感器读数机上（SDR）,读数机通过微孔板底板以非侵入方式对传感器进行读数。这种小巧而结实的仪器适用于孵化器和摇瓶装置。

图2.  PreSen公司的氧气传感器按照动态的荧光消失原理进行工作，氧气能减弱荧光强度以及降低指示剂染料的弛豫时间。

细胞培养过程中的变化

传感器读数器（SDR）常用于生物技术生产中，其典型应用之一是CHO细胞的培养。在以下实验中，将两个SDR相连，利用氧气和pH值传感器平行地进行测量。将细胞株妥善安放于悬浮培养液中，按照每孔1.2ml的样品体积培养12天以上。采用4种不同的细胞浓度（每毫升细胞数为：50，2×103，2.5×104和3.2×105）平行地进行检测，旨在确定仪器针对每个样品在涉及细胞检测限时呈现何种灵敏度。耗氧量直接依附于细胞浓度以及培养时的物料更换情况（见图3）。具有最高细胞浓度的样品于数小时后就显示出含氧量下降至不足空气饱和程度的9%，这一骤然降低的过程在每次更换培养介质时均会出现。大约5天后含氧量降低至最低程度，而10天后介质中的氧浓度又出现轻微上升。在悬浮培养过程中，经常可能无意识地从培养中搞掉一些细胞，这也许是导致每次更换培养介质时出现偏差的原因。具有较小细胞密度的样品显示出类似的动力学现象，仅在时间上稍有延迟而已，显微镜分析表明：具有较高细胞密度的样品中放置长时间后会形成细胞集聚物，这样有可能影响氧气动力学：细胞复合体在更换培养介质时可能松解，而细胞集聚物结构对细胞物质交换的妨碍作用会越来越明显，这也许就是为什么10天后含氧量增加到15%空气饱和度的原因。

摇瓶应用

摇瓶广泛应用于工业生物反应过程。将PreSens公司的一次性传感器安置于细颈瓶中，通过摇瓶读数装置（SFR）读数，采用这一系统可对多达9个摇瓶的氧气和pH值进行同时监测，并可获得培养进程中的氧气供应和物质交换方面的图像。这种摇瓶读数装置几乎与所有型号的摇瓶相适应，并备有蓝牙接头器，方便与电脑进行无线连接，以进行实时监测。

图3.  具有不同起始细胞密度的CHO-S细胞培养过程中的氧气消耗，在多孔微孔板上借助传感器碟读书器完成测量。

为了检验SFR的运行情况以及数据的准确性和重现性，在设备齐全的玻璃瓶和设备不齐全的塑料瓶中同时培养大肠杆菌DH5α，所有的瓶子都带有氧气传感器，而每个塑料瓶则各具一个pH传感器。为了检查测量的重现性，对摇瓶采用了类似于kLa的方法进行平行性试验。（kLa是一种特殊的系数，用以量化在一种特定介质中的氧气传递速率）。每个培养瓶均于37℃进行重复性试验，并按照启动时的摇动频率90rpm进行。当采用具全套设备的玻璃瓶培养时，如果培养以0.1的光学密度（OD 600nm）进行，则溶解氧的浓度呈加速下降的趋势。为了避免氧气不足的限制，将摇动频率在2h内从90rpm提高到120rpm, 3.5h后由120rpm再提高到170rpm。细菌培养实验表明：在头2h内呈现明显的指数式增长，而在其后的时段内LB细菌基础培养基中不同的提取物已被消耗掉，细胞物质交换的调整可以从溶解氧（DO）曲线的明显上升体现出来。

5h后将摇动频率重新调回到120rpm，此时细菌的呼吸活性逐渐减少，溶解氧的含量缓慢上升。在设备不完整的塑料瓶中进行的培养，其溶解氧和pH走向表现出明显的差异，氧气的供应出现明显不足。由此表明：设备不完整的塑料瓶不适合培养像大肠杆菌这类需氧性的快速生长的细菌。

图4. 在复合的LB细菌基础培养基中，两种采用大肠杆菌DH5α-alpha进行批次培养时所用的溶解氧和pH值的时间变化曲线。（A）：在带全套设备和集成有氧气传感器的250ml玻璃摇瓶中；（B）：在不带全套设备但集成有氧气传感器和pH传感器的250ml塑料摇瓶中。所用培养均在37℃的环境下，按照启动时的摇动频率90rpm进行，摇动频率改变以箭头表明，平行培养的测量数值已经列出。

改善生化反应过程

采用化学光学监控仪器还有利于改善生物反应器的反应过程，使结果重现性更好。将带有传感器的流通池通过Luer-lock适配器集成于外管之中，或预置在透明的生物反应器的璧中，这样就能够在整个流程中进行非侵入式测量。

另一个优点在于生物反应器的二氧化碳监测，在二氧化碳含量升高至不利水平时能够及时地作出反应，并将氧气导入样品的顶部空间。化学光学测量仪器与传统的电化学系统比照实验，考察了化学光学传感器应用于生物反应器的效率，3周的培养期内，对溶解氧和二氧化碳的浓度在CHO细胞的浓度进行了测量，两者的结果非常接近，而化学光学传感器系统的灵敏度显著高于传统测量仪器。

小结

光学传感器能够对溶解氧、二氧化碳和pH值进行快速、精确的测量。对于特殊情况，例如氧气含量的下降、有害性pH值或者生物反应器中不利的二氧化碳浓度，能够及时采取应对措施。

采用一次性传感器，能在整个生物技术开展过程的各个环节上，对重要的培养参数进行非侵入式的监测，适用范围从毫升级的研究规模到生产中的生物反应器级别。这一技术对改进培养的重现性和质量能够发挥重要的作用，因而在一系列研究项目中得到应用。

光学传感器技术

过程参数如pH值、氧气和二氧化碳的监测对于培养过程的进行具有极其重要的意义。如果采用传统的传感器进行监测，这些传感器会对培养过程产生影响，而一旦将样品从反应器中取出检测，就不再是连续监测了。在这种情况下，光学传感器一次性系统可作为最佳选择，对这些参数进行不间断监测而非侵入式的测定。