MALDI-MS：蛋白组学研究的推动力

有如此多的蛋白质需要研究，蛋白组学专家感觉到需要加快速度了。基质辅助激光解吸质谱，或称作MALDI- MS因此应运而生。范德比特大学（Vanderbilt University）医学院质谱研究中心主任Richard Caprioli博士表示：“只要样品制备顺利完成，就可以很轻松地在接下来的步骤中获得数据。”但是，这只是许多科学家用MALDI进行蛋白组学研究的最初原因。实际上，MALDI揭示了许多蛋白质的特征。Shimadzu公司生命科学业务部主管Scott Kuzdzal博士介绍：“MALDI MS在蛋白组学方面具有广泛的应用，包括肽和无损蛋白质质谱分析，多个样品类型的质量控制，用于蛋白质鉴定的肽质量指纹谱分析，翻译后修饰的分析，以及最近在组织成像和生物标记发现方面的应用。”

可是，要想获得MALDI的全面应用，还需要为该技术增加一些辅助设备。而且，当MALDI MS与其它方法结合使用时，才能发挥最佳工作状态。

灵敏度和序列测定

在生物技术领域，更高的灵敏度一直是科学家近年，甚至是近10年来关注的重点，MALDI MS正好满足了这一需求。Thermo Fisher公司的产品经理Mari Prieto Conaway博士说：“我们的MALDI LTQ XL就是基于最敏感的离子阱之上的MALDI离子化来源。”此外，她还补充说， MALDI Orbitrap XL和MALDI LTQ Orbitrap Discovery能达到1~3ppm的质量精确度。、

此外，Thermo Fisher公司的MALDI产品也可与多重质谱或MSn一起使用。Conaway说：“MSn意味着我们的设备并不停留在MS/MS水平。对于检测蛋白质中的翻译后修饰来说，MS3非常重要，它能阐述前导分离物中的同量异位物种的差异。”

MALDI还可分析膜蛋白或蛋白质关联的化合物，在植物或低等有机物中发现的蛋白质，通常来说，采用传统的液相色谱-质谱法（LC/MS）很难对这些物质进行分析，而这恰恰是MALDI的强项。

除了获得更高的灵敏度，MALDI MS也能用于测序。德国Bruker Daltonics公司的MALDI-TDS便可用于全序列的测定，与smartbeam激光一起使用的ultraflex III MALDI TOF/TOF可提供自上而下测序。简言之，自上而下方法可以在不采用任何蛋白水解消化的情况下，就可以得出特定的蛋白质序列，而自下而上方法是将样品中的所有蛋白质消化，然后利用数据库将碎片整合到一起。Bruker Daltonics公司的MALDI应用研发和蛋白组学主管Detlev Suckau博士表示：“MALDI-TDS可对未经消化的质量为5~100千道尔顿的蛋白质进行测序。”

而且，这种仪器可提供有关N末端和C末端的直接信息，蛋白质亚型，翻译后修饰作用以及体内的蛋白质水解情况。他补充道：“只有top-down的分析方法提供了了解这些情况的路径，而这些情况对各种疾病来说很重要，如癌症。”这也是组织成像采用MALDI与生物标记发现高度相关的原因所在：top-down方法可监控蛋白水解情况，而鸟枪蛋白组学方法无法做到这一点。这里，大规模的axial MALDI-TOF设备可提供用于成像的蛋白质质量高达20千道尔顿，甚至更大。

图3 AXIMA Perfortmance 是一种能研究蛋白组学和糖组学等其他生物学内容的MALDI TOF/TOF质谱。

虽然MALDI MS提供了快速观察蛋白质的方法，它也能用于其他的化合物。例如，Kuzdzal说道：“Shimadzu公司的AXIMA-QIT可用于荧光蛋白组学和糖组学。”而且，该公司制作的MALDI MS设备提供了碰撞诱导的解离。能获得有关大量化合物的MS/MS光谱信息，包括肽，糖，类脂，小分子等。

成像技术进展

除了鉴定蛋白质，MALDI MS也能定位蛋白质所在的位置。不是在质谱仪面前将整个样品碾成粉，MALDI成像是在组织中的特殊部分寻找蛋白质。在一些例子中，分辨率可以高达5μm，比大多数哺乳动物细胞还小。Caprioli表示：“这不是科学幻想，但你必须控制实验参数，以获得高重现性结果。”虽然有对照，Caprioli还是感到很吃惊。例如，在观察肿瘤边缘时，Caprioli发现了蛋白质定位模式。他说：“我们能测量上百种蛋白质，并且我们发现：一些与癌症发病机制有关的蛋白质，穿透进入正常组织的能力远远高于我们的预期。”相对外科手术后不太可能复发的癌症，这种分子信息可以对外科手术之后可能复发的癌症进行鉴定。

Caprioli也采用MALDI成像技术去追踪小鼠中的一种药物及其代谢产物。“我们能看到药物在何处终止，以及药物的代谢过程。该技术还能检测周围蛋白质在药物终点的变化。”Caprioli说。

虽然Caprioli最初开发了自己的成像设备，一些公司还是提供了用于MALDI成像的产品。据Suckau介绍，Bruker Daltonics公司的MALDI分子图像仪，提供了30~50μm的分辨率。他还称，与多重变量统计学相比，该设备提供了一个强大的生物标记探测平台，去鉴定那些标记候选物，并且将数据用于病理学和临床研发。

图4 MALDI MS能定位样品中的蛋白质位置。图中是一个移植到小鼠中的人脑瘤， MALDI MS成像显示了来自肿瘤（红色）的蛋白质和一个来自正常组织的（绿色）蛋白质。

此外，Thermo Fisher的MALDI工具也可用于成像研究。Thermo Fisher公司蛋白组学营销项目经理Amy Zumwalt表示：“如果一种药物被开发用于癌症治疗，那么这种药物将吸引特定的肿瘤，因此MALDI成像也能用于药物研究的其它领域，例如用于神经变性疾病治疗药物的搜索，你可以取一个脑切片，观察大脑的整个细节以及药物代谢的路径。”

覆盖各个角落

虽然采用MALDI电离质谱有许多益处，但它也不是万能的，不能鉴定出所有样品中的所有蛋白质。Waters公司MALDI Synapt产品经理 Ronan O'Malley说：“为了尽可能多的鉴定蛋白质，科学家可能希望把MALDI与电喷射电离一起使用。”

使用MALDI Synapt，研究人员能获得两种离子化形态，这也意味着用户能获得全部的电喷射蛋白组学解决方案，从而在一个设备中获得两种研究平台。

MALDI Synapt高分辨质谱仪还有一些优点，例如，因为采用正交几何，测量结果是由推动器到检测器的离子飞行时间决定的。此外，不用必须考虑放射源的飞行时间，因此放射源中的任何能量速度对分辨率和质谱设备不会产生有害影响。相比轴系统，正交系统在全部的质量范围内提供了一个恒量的分辨率、更好的质量精确度（2ppm）、以及时间上更好的校准稳定性。O'Malley说：“使用四极杆进行离子选择，能够选择你想进行MS/MS分析的离子。这也提供了一个更高的可信度，因为你正在寻找的碎片来源于你所选择的前导物。”

此外，该仪器还将离子迁移率分离整合到质谱中。O'Malley介绍说：“第一次采用MALDI仪器，你可以通过大小、形状、电荷以及质量进行分离。而采用离子迁移率后，就能分离等比重的离子，而以前是无法做到这一点的。因此，你可以鉴定样品中更多的肽，以及更多的蛋白质。”

此外，O'Malley 说：“离子迁移率分离还将为MALDI Synapt增加一些新分离能力。对于MALDI成像来说，离子迁移率对干扰离子的成分分离尤为重要，同样对个体分子物质的分离也非常重要。”

多种技术的整合

虽然MALDI MS具有许多优点，并且研究人员和公司在持续开发新产品，但是它不能解决蛋白组学中的每一个问题。Caprioli表示：“如果有人告诉你，任何技术没有缺陷，不要相信他们！”说到蛋白组学，虽然他发现了MALDI MS的大量用法，但他也认为LC/MS/MS有很多优点，不同的技术总是倾向于解决全体蛋白质中不同部分蛋白质问题。

实际上，技术的多样性也增加了研究人员理解蛋白质组的能力，一种技术可能展示了另一种技术所不具备的优点，同样，也可能证实另一种技术的成果。因此Caprioli认为：“我们正在查看蛋白组学蛋糕中很小的片段，并且设法去了解它。MALDI仅为我们展示了一块蛋糕的图片。”为了全面了解蛋白质组这一大蛋糕，研究人员必须将多种技术组合在一起使用。