图1(反相). 三聚氰胺标样图谱。
仪器、试剂与材料
仪器：本实验使用Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪系统，含LC-20AD输液泵，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，SPD-20A紫外可见检测器，CBM-20A控制器，DGU-20A3在线脱气机。另外，还使用到如下设备：高速离心机（转速可达到10000r/min以上）、漩涡混合器、超声波清洗器、氮吹仪（控温60℃以上）、固相萃取装置、震荡摇床。
图2(反相). 5μg/ml标样连续5针进样重叠图谱。
试剂：甲醇，色谱纯：乙腈，色谱纯：氨水，浓度25%~28%；混合性阳离子交换固相萃取柱，60mg，3ml；三氯乙酸溶液10g/L，称取10g三氯乙酸加水至1000ml；氨水甲醇溶液，量取5ml氨水，溶解于100ml甲醇中；乙酸铅溶液22g/L，取22g乙酸铅用约300ml水溶解后定容至1L；乙腈溶液，75ml乙腈加入25ml纯水，混匀；缓冲液，配制含10mM柠檬酸和10mM辛烷磺酸钠的缓冲液，调节pH值到3.0；三聚氰胺标准品（纯度＞99%）。
流动相：将缓冲液与甲醇按照7:3比例混合，用0.45μm的滤膜过滤后备用。
三聚氰胺标准储备液：称取50mg（精确到0.1mg）的三聚氰胺标准品，用乙腈溶液溶解并定容于100ml容量瓶中，该溶液浓度为0.5mg/ml，于4℃冰箱内贮存，有效期3个月。
图3(反相). 校准曲线。
三聚氰胺标准工作液：分别吸取适量标准储备液，用缓冲液稀释成浓度为0.5μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的标准工作液。于4℃冰箱内贮存，有效期1周。
样品前处理
（1）提取
奶粉样品取样5g，准确加入50ml三氯乙酸溶液，加入2ml乙酸铅溶液摇匀，超声提取20min，转入离心管，在10000r/min离心机上离心5min，取上清液。
图4(反相). 空白奶粉。
（2）净化
分别用3ml甲醇，3ml水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，取上清液分次上柱，控制过柱速度在1ml/min以内。再用3ml水和3ml甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽近干后用氨水甲醇溶液3ml洗脱。洗脱液50℃氮气吹干，准确加入缓冲液，漩涡振荡1min，0.45um滤膜过滤，上机测定。
表1(反相). 保留时间与峰面积的重现性（方法精密度验证）
色谱分离条件
本实验所用色谱柱为GL Sciences C8 4.6×250mm 5um；检测波长设定为235nm；流速1ml/min；柱温 40℃；进样量为10μl；等度洗脱。
表2(反相). 3个不同浓度样品回收率
流动相配制方法如下：首先配制含10mM柠檬酸和10mM辛烷磺酸钠的缓冲液，调节pH值到3.0。将缓冲液与甲醇按照7:3比例混合，用0.45μm的滤膜过滤后备用。
实验过程与结果
三聚氰胺标准贮备液（1mg/ml）：准确称量100.6mg三聚氰胺标准品于100ml容量瓶中，用流动相溶解并准确定容至刻度，并用0.45μm的滤膜过滤，备用。
图5(反相). 空白奶粉加入0.5mg/kg三聚氰胺。
（1）保留时间与峰形
图1为本方法检测三聚氰胺标样的典型色谱图（样品浓度为1μg/ml），由图1可见，本方法所测三聚氰胺保留时间为11.02min，峰形尖锐，对称性好。
（2）标样精密度
取浓度为5μg/ml三聚氰胺标样，连续进样5次，结果如表1所示，由表1结果可见，本方法测定三聚氰胺具有很好的精密度和重现性。5针图谱如图2所示。
（3）线性关系
取标准工作液分别进样，得到校准曲线如图3所示，相关系数为0.9999，线性度良好。
（4）加样回收率
取奶粉空白样品，分别加入适量三聚氰胺标准工作液，使其三聚氰胺终浓度分别为0.5mg/kg，5mg/kg和50mg/kg，另外取阳性样品一个，共一个空白和四个样品。空白称量一份，每个样品各称量两份，总共9份，按照样品前处理方法进行提取纯化。结果如图4、5、6、7所示。
图6(反相). 空白奶粉加入5mg/kg三聚氰胺。
从图中看出，空白奶粉也检测出少量三聚氰胺。由于本次实验时间限制，无法挑选到一个合格的空白奶粉。这是可以改进的地方。
表3(反相). 保留时间与峰面积的重现性
计算3个不同浓度样品回收率如表2所示。
由表2可见，本方法检测三聚氰胺回收率一般。这是由于实验条件限制，无法对50ml以上液体进行一次性离心，因此称取的样品量和加入的试剂量均为标准提取方法的十分之一，即称取0.5g奶粉，加入5ml三氯乙酸溶液和0.2ml乙酸铅溶液。氮吹仪吹干后，加入0.5ml缓冲液溶解。如果实验条件改进，回收率能有很大改进。
图7(反相). 空白奶粉加入50mg/kg三聚氰胺。
（5）样品结果重现性
取加样量为5mg/kg样品，提取纯化后，连续进样5次，结果如表3所示。
由表3结果可见，本方法测定样品中三聚氰胺具有很好的重现性。
（6）检测限
用软件计算出检测限和定量限如表4所示。
表4(反相). 软件计算出的检测限和定量限（μg/ml）
结论
通过上述实验结果可见，本方法具有操作简单方便，灵敏度高和重现性好等优点，适用于奶粉中三聚氰胺含量的检测。
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