赛默飞世尔荧光分光光度计应用指南

简介

荧光量子产率是影响荧光基团荧光寿命的一个重要因素。 荧光量子产率是物质发射荧光的总能量与吸收能量的比值。_Q = photons_em photons_abs量子产率的测定方法分为相对法和法两种。“绝对”量子产率的测量需要更加复杂的仪器，而确定荧光的“相对”量子产率则较为简单。相对量子产率测量又分为两种方法：“一点”法：对于稀溶液，荧光强度与激发光强度以及荧光量子产率之间有如下关系：F =KIAφ，其中F是荧光强度，K是仪器常数。激发光强度，c样品浓度，l吸收池光径，ε样品吸收系数，φ量子产率。这里clε可用光密度A表示。F=KI₀Aφ。将两个溶液的荧光强度进行比较：F₁/F₂=K₁I₀₁A₁φ₁/ K₂I₀₂A₂φ₂若两者使用相同的装置和测试条件，则F₁/F₂= A₁φ₁/A₂φ₂,即φ₁/φ₂= F₁A₂ / A₁F₂分别测定待测荧光试样和已知量子产率的参比荧光标准物溶液的积分荧光强度（即荧光光谱所包括的积）以及对一相同激发波长的入射光的吸光度（使用紫外可见光度计），带入上述公式即可求得待测样品量子产率。运用此公式时一般要求吸光度低于0.1（zui好0.05）。第二种就是威廉姆斯等人的“比较法”，该方法使用特征明确的荧光量子产率已知的参照物，选取4-6组浓度，吸光度在0.1-0.01之间逐渐递减（当然0.05-0.01更好），每一个浓度对应测量一个荧光积分，然后算出斜率，两个物质的斜率再相比得出荧光量子产率。在该实验中，采用了比较法，而通过与参照物罗丹明6G（其荧光量子产率为0.95）比较，来确定了罗丹明B的荧光量子产率。

试剂和仪器

1.罗丹明B，罗丹明6G：通常用作荧光分析时检测DNA、RNA和蛋白质的试剂。

2. 乙醇

3.Evolution201紫外可见分光光度计

4.Lumina荧光分光计

5.Luminous软件软件

6.荧光比色皿(光束路径长度为10 mm)。

实验步骤

1.罗丹明B和罗丹明6G各制备4至5个样品，在激发波长为535 nm时具有不同的吸光度（0.01-0.1）。

2.固定激发波长为535nm，测量制备的样品荧光。

3.计算全光谱荧光强度（即荧光光谱的面积）

4.绘制一张全光谱荧光强度对比吸光度的图。

5.计算荧光量子产率

仪器参数

扫描模式：发射 激发狭缝：2.5 nm

数据模式：荧光 发射狭缝：2.5 nm

重复次数：1 激发光滤镜：空气

重复间隔：1 激发光滤镜：空气

PMT电压：700 V 激发波：535 nm

扫描速度：300 nm/min 发射开始：500 nm

积分时间：20 ms 发射结束：700 nm

应答时间：0.1 s

实验结果

图3.是罗丹明6G与罗丹明B的吸光度和荧光光谱。荧光光谱的面积可利用图4中面积计算方式计算得出。

图3：罗丹明6G（上）与罗丹明B（下）的吸光度（左）和荧光（右）光谱。

图4荧光光谱面积

表1：吸光度对比荧光光谱面积

利用以下公式计算量子产率：Grad   n^2 Q = ^Q R  Grad_R    n_R²

其中，Grad是从全光谱荧光强度与吸光度图中获得的线性拟合梯度。n是溶剂的折光率，下标R是指已知量子产率的参考荧光团。如果在参照物和未知样品中均采用乙醇作为溶剂，(n²/n²R)将为1，因此荧光量子产率(Q)只有在计算Grad之后才能得出。实验得出的吸光度对比荧光面积图以及线性拟合的结果如图5所示。

图5. 吸光度对比荧光面积

在公式中插入Q值0.95（以罗丹明6G的荧光量子产率作为参考），然后计算如下

zui终，得出的罗丹明B的荧光量子产率为0.69，非常接近文献量子产率 0.7。

一点法对比梯度法

一点法用于确定荧光量子产率，其优点是能比梯度法更快获得结果。利用以下公式计算未知样品的量子产

率：an style="mso-spacerun:'yes';font-family:'Times New Roman';font-size:14px;" >0.95

其中，Q是荧光量子产率，I是全光谱强度，n是溶剂的折光率，OD是光密度。下标R是指已知量子产率的参考荧光团。

通过比较，比较法准确性优于单点法测试。