实时荧光定量PCR扩增曲线包括基线期,指数扩增期,线性扩增期和扩增平台期,标准的曲线应该呈典型的S型。
不规则曲线可以根据曲线的具体情况来分析:
1)曲线呈斜线上升
原因:热盖失灵或热盖没盖紧,导致控温不准、液体挥发。
解决办法:更换仪器热盖或将热盖盖紧。
图1 曲线呈斜线上升
2)扩增曲线分成两段(断裂)
图2扩增曲线分成两段(断裂)
原因:基线的终点大于Ct值,通常是因为模板DNA浓度偏高,CT值< 15,而基线仍然取3-15,其中包含部分扩增信号,导致曲线被压下去。
解决方法:减小基线终点,至Ct值前4个循环,重新分析数据。
3)直线扩增曲线
图3 某些样本出现直线扩增曲线
原因:探针部分降解
解决办法:建议更换试剂进行测试。
4)曲线平台期下掉
原因:盖子没盖紧
解决办法:PCR反应管盖子盖上后,检查盖子是否盖紧。