12 问：分析HPLC如何放大到制备型HPLC？
在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级，甚至更低。样品量和固定相之比有的甚至小于1:10000。进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积（小于1:100）。 在这种条件下，会达到很好的分离效果，峰形尖锐并且很对称。
分析系统线形放大到制备型HPLC意味着使用直径更大的制备柱、更高的流速和根据色谱柱的长度增加进样量并保持样品浓度不变。峰形仍会保持尖锐而对称。这种方法需要大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样品，但这种方法从经济上一般不合适。
在制备液相中，最大的区别就是超量进样。制备的分离峰形一般不可能仍会保持尖锐而对称，分析和制备是不同的概念。制备的首要概念是在达到纯化的基础上，降低成本，加快时间（提高效率）。一般说来，纯化的成本要高于生产粗产品的成本，所以，可以加大上样量，甚至过载，出现平头峰，而收集只集中在峰的一小部分，以来保证纯度，主要为了节省流动相和提高设备利用率。
13 问：制备纯化蛋白、多肽，耗用流动相惊人，请问这些用过的流动相（乙腈，甲醇）可以重蒸使用吗？
流动相用一般减压方法重蒸后，往往会形成有机溶剂和水会共沸，另外，由于减压蒸馏属于单次平衡，往往得不到100%纯度的溶剂，这会使溶剂的配置有一定困难，从而使色谱的重现性和分离度会发生一定的变化。如果要求不是很高的话，一般可以分析重蒸后馏分中的各组分含量，计算后再使用。
要通过重蒸得到纯物质是极其困难的，必须采用精馏塔多级蒸发，单就设备投资和能耗来讲，实验室规模或生产规模的废液回收处理已经是得不偿失。其实，我们没有必要得到纯的物质。
作者：草甘膦
14 问：反相色谱分离纯化后，怎样除去流动相产品中的TFA和乙腈或其他杂质？
TFA是反相色谱分离中常用的添加剂。可以用冻干的办法去除，国外许多文献是这样报道的。还可以试试离子交换、凝胶层析、甚至透析和超滤，其中，离子交换层析效果比较好，还可以起到浓缩样品的作用。
首先，冻干的办法应该可以几乎彻底地除去TFA和乙腈，药物实验前最好先检测一下冻干品中的残留量，只要不超过允许范围，这种办法是最最简单、有效的。
其次，如果你的药物的分装量不大的话(<100ug)，建议你用离子交换层析，最好装一个小一点儿的柱子，让含盐洗脱峰的蛋白浓度达10mg/ml以上，稀释后完全符合试验要求。如果用分子筛，考虑稀释，最好也先过一个离子交换。此外可以试试疏水层析。如果产品是碱的话，可能会形成TFA盐，这样通过上述方法就无法除去。一般可以用碱水洗，然后将产品萃取出来。或者在里面加入一定量的盐酸，再干燥后形成盐酸盐。
15 问：同一种填料的分析柱、制备柱按线形放大公式套，分离度会不会变化？
一般会有一定的变化，原因有以下几点
（1） 制备柱的装填是否均匀，如不均匀则可能产生涡流扩散使各个组分的经过通道的直径不同、阻力不一样，停留时间不同，色谱峰可能变宽。
（2） 如果样品在流动相中溶解度小，在制备色谱上会有不同的峰展宽。
（3）如果样品在分析柱上有展宽或拖尾的现象，放大到制备柱上后峰的展宽和拖尾经常会非常严重，导致分离失败。
16 问：制备色谱柱如何测柱效？
可以选择几种物质，苯，甲苯，萘、蒽等的衍生物上柱，流动相一般用65-80%的甲醇/水，测定后根据保留时间计算塔板数。由于制备色谱的管路死体积一般比较大，很难得到和供应商相同的柱效。建议在制备柱开始使用时在自己的色谱上测一下柱效，然后定期检测柱效进行以进行比较。
17 问：反相色谱分离后，如何快速从流动相中得到产品？
可以考虑先在低温下，减压旋蒸除去其中的有机溶剂，然后用萃取的方法（如乙醚、氯仿萃取等）把产品萃取出来，然后再低温再旋蒸，这样，就可以不将温度升得很高而得到产品。
如果要直接蒸掉流动相，水泵的真空度要注意（要检查气密性），否则蒸水会很慢。一般比较好的泵在60-70度即可蒸掉水，如果泵的真空度不好，可能需要80-90度才行，这样容易暴沸导致样品损失。另为，温度太高可能引起物质变性。
HPLC的故障及处理
一) 保留时间变化
1.柱温变化 柱恒温
2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够 用>25mmol/L的缓冲液
4.柱污染 每天冲洗柱
5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相
6.柱快达到寿命 采用保护柱
(二) 保留时间缩短
1.流速增加 检查泵,重新设定流速
2.样品超载 降低样品量
3.键合相流失 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀
5.温度增加 柱恒温
(三) 保留时间延长
1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
3.键合相流失 同前(二)3
4.流动相组成变化 同前(二)4
5.温度降低 同前(二)5
(四) 出现肩峰或分叉
1.样品体积过大
用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
2.样品溶剂过强
采用较弱的样品溶剂
3.柱塌陷或形成短路通道
更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
4.柱内烧结不锈钢失效
更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.进样器损坏
更换进样器转子
(五) 鬼峰
1.进样阀残余峰
每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
2.样品中未知物
处理样品
3.柱未平衡
重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)
每天新配,用抗氧化剂
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