毛细管电泳实验讲义（二）

表1  6种CE分离模式的分离依据及应用范围

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毛细管区带电泳（CZE）是最简单的CE模式，因为毛细管中的分离介质只是缓冲液。在电场的作用下，样品组分以不同的速率在分立的区带内进行迁移而被分离。由于电渗流的作用，正负离子均可以实现分离。在正极进样的情况下，正离子首先流出毛细管，负离子最后流出。中性物质在电场中不迁移，只是随电渗流一起流出毛细管，故得不到分离。

在CZE中，影响分离的因素主要有缓冲液的种类、浓度和pH值、添加剂、分析电压、温度、毛细管的尺寸和内壁改性等。缓冲液种类的选择主要考虑其pKa值要与分析所用pH匹配，另外，有的缓冲液与样品组分之间有特殊的相互作用，可提高分析选择性。比如，分析多羟基化合物时，多用硼酸缓冲液，因为硼酸根可与羟基形成络合物，有利于提高分离效率。增大缓冲液的浓度一般可以改善分离，但电渗流会降低，因而延长了分析时间，过高的盐浓度还会增加焦耳热。缓冲液的pH主要影响电渗流的大小和被分析物的解离情况，进而影响被分析物的淌度，是CZE分析中最重要的操作参数之一。缓冲液添加剂多为有机试剂，如甲醇、乙腈、尿素、三乙胺等，其作用主要是增加样品在缓冲液中的溶解度，抑制样品组分在毛细管壁的吸附，改善峰形。提高分析电压有利于提高分离效率和缩短分析时间，但可能造成过大的焦耳热。温度的变化可以改变缓冲液的粘度，从而影响电渗流。毛细管内径越小，分离效率越高，但样品容量越低；增加毛细管长度可提高分离效率，但延长了分析时间。有时为了改善分离，要对毛细管内壁进行改性，比如采用涂层技术。

5．毛细管电泳的基本参数

CE中的分析参数可以用色谱中类似的参数来描述，比如与色谱保留时间相对应的有迁移时间，定义为一种物质从进样口迁移到检测点所用的时间，迁移速率（n）则是迁移距离（l，即被分析物质从进样口迁移到检测点所经过的距离，又称毛细管的有效长度）与迁移时间（t）之比：

                              （8）

因为电场强度等于施加电压(V)与毛细管长度(L)之比：

                                   （9）

就CE的最简单的模式—毛细管区带电泳（CZE）而言，结合式（1），可得：

                        （10）

在毛细管区带电泳(CZE）条件下测得的淌度是电泳淌度与电渗流淌度的矢量和，我们称之为表观淌度m_a，即：

                     （11）

实验中可以采用一种中性化合物，如二甲亚砜或丙酮等，来单独测定电渗流淌度，然后求得被分析物的有效淌度。例如，图4是一个混合物的分离结果，其中三个峰分别为阳离子（t = 39.5s）、中性化合物（t = 66.4s）和阴离子（t = 132.3s）。实验用毛细管总长度为1212.5px，有效长度（从进样口到检测点的距离）为1000px，施加电压为20kV。根据上述公式，我们便可以计算出电渗淌度以及不同离子的表观淌度和有效淌度。

电渗淌度：

阳离子：

阴离子：

注意，阴离子的有效淌度为负值，因为其电泳淌度与电渗淌度的方向相反。

实验设备：每四人一组共用一台Capel-103RT电泳仪。

仪器及试剂：

5 mL移液管2只，1mL 移液管共2支，分别标上四种标样的标签，两组公用。每组10 mL容量瓶2个，滴管2支，分别标上标准、未知的标签。塑料样品管共16个，每组8个，分别用于标准样品、未知样品、三种缓冲溶液、NaOH、水和废液，做好标号。滴瓶一共5个，分别装三种缓冲液(buffer)、1mol/L的NaOH和乙醇。镊子、洗瓶、吸耳球、试管架、塑料样品管架、废液烧杯每组一个。剪刀一把，记号笔一支，滤纸。

标样：苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、对氨基水杨酸，均溶于二次水中，浓度1.00 mg/mL，作为标准品，混合稀释作为标样。另有一个预先配制的未知浓度混合样品。

缓冲溶液(buffer)：10 mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄ 1:1缓冲溶液(NaH₂PO₄和Na₂HPO₄ 各5mMol/L)，20 mmol/L HAc-NaAc pH为6 (HAc:NaAc大约1:15)缓冲溶液，20 mmol/L Na₂B₄O₇缓冲溶液。

1mol/L NaOH溶液，二次去离子水。

实验步骤：

1．仪器的预热和毛细管的冲洗：在实验教师的指导下，打开仪器和配套的工作站。工作温度设置为30℃，不加电压，冲洗毛细管，顺序依次是：1 mol/L NaOH溶液5 min，二次水5 min，10 mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄ 1:1缓冲溶液5 min，冲洗过程中出口(outlet)对准废液的位置，并不要升高托架。

2．混合标样的配制：毛细管冲洗的同时，配制混合标样。分别用5ml的移液管移取3ml苯甲醇、3ml苯甲酸，用1ml的移液管移取1ml水杨酸、0.5ml对氨基水杨酸于10ml的容量瓶中，定容，得到苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、对氨基水杨酸浓度分别为300μg/mL、300μg/mL、100μg/mL、50.0μg/mL的混合溶液作为混合标样。（试思考为什么不采用浓度一样的混合溶液作为混合标样？）

3．混合标样的测定：待毛细管冲洗完毕，取1 ml混合标样，置于塑料样品管，放在电泳仪进口(Inlet)托架上sample的位置，然后调整出口(outlet)对准缓冲溶液(buffer)，升高托架并固定，然后开始进样。进样压力30 mbar，进样时间5 s。进样后将进口(Inlet)托架的位置换回缓冲溶液(buffer)，切记换回buffer的位置！选择方法2004CE.mtw，修改合适的文件说明，然后开始分析，电压25 kV，时间约10 min。

4．未知浓度混合样品的测定：方法与条件同上，测试未知浓度混合样品，分析时间约10 min。

5．不同缓冲溶液下迁移时间的变化：未知浓度混合样品的测定完毕后，冲洗毛细管，顺序依次是：1 mol/L NaOH溶液5 min，二次水5 min，然后更换进出口两端的缓冲溶液为20 mmol/L Na₂B₄O₇，冲洗5 min；并在此条件下测试未知浓度混合样品，电压25 kV，时间约10 min。按照前面的顺序再次冲洗毛细管，再次更换进出口两端的缓冲溶液为10 mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄ pH为6，冲洗5 min；并在此条件下测试未知浓度混合样品，电压25 kV，时间约15 min。

6．完成实验以后，用水冲洗毛细管10 min，一天中的第二组(4:00-7:00)的同学用水冲洗以后再用空气吹干10 min。

7．打印报告，清理实验台。

数据处理：

1．根据电泳的原理，判断两组混合标样中4个峰各自的归属(需要查找被分析物的pKa值)，找到在未知浓度混合样品中与之迁移时间一致的峰。

2．按照已知浓度峰的积分面积之比折算未知浓度混合样品中各个组分的浓度（外标定量法）。

3．计算各个组分的表观淌度和有效淌度，并说明哪个组分可以作为电渗流标记物。本次CE实验使用的毛细管总长度L＝1250px，有效长度l＝1012.5px。

4．根据电泳的原理，判断在另外两种缓冲溶液下，各个峰的归属，并对各个组分迁移时间的变化做出合理分析和讨论。

注意事项：

1．冲洗毛细管时禁止在毛细管上加电压；不允许更改讲义上给定的工作电压，也不建议改变进样时间。

2．样品和缓冲溶液之间的切换是手动的，在实验过程中要随时注意是不是放在正确位置；如果在分析时将样品或者洗涤液当作缓冲溶液，请停止分析并重新用对应缓冲溶液冲洗管路10 min。因为电泳是需要在同一个下午和其他实验交换的四学时实验，这样有可能会耽误时间，希望引起注意。此错误一经证实，每一次扣掉10%实验成绩。

3．冲洗毛细管对于实验结果的可靠性和重现性至关重要，务必认真完成每一次冲洗，不允许缩短冲洗时间或者不冲洗。

4．做完实验以后一定要用水冲洗毛细管，一天做完以后要用空气吹干，否则可能会导致毛细管堵塞，严重影响后面组的同学实验，希望引起足够的重视。

5．塑料样品管的里面容易产生气泡，轻敲管壁排出气泡以后方可放入托管架。

6．合理分配实验时间，注意一组四个同学之间的分工合作，每个同学均要实际操作冲洗、进样、分析全过程一次。