斑马鱼的基因敲除定制（Cas9-KO）法介绍

利用 CRISPR/Cas9 技术，针对靶基因序列设计 sgRNA， 指导 Cas9 蛋白在特定基因位点引起 DNA 双链断裂，在非同源性末端接合修复断裂 DNA 的过程中，靶基因碱基突变或缺失被引入到斑马鱼基因组中，最终导致靶基因无法正常转录翻译，达到基因敲除的目的。目前我们利用 CRISPR/Cas9 技术，提供 TU 品系的基因敲除斑马鱼制备，TU 系是最为普遍使用的标准纯遗传背景品系之一。同时也可根据委托方的需求，提供 AB 以及其它遗传背景的基因敲除斑马鱼服务。 

• 班马鱼基因靶向改造敲除突变体的建立技术路线

  • 分析目标基因的基因组结构，确定目标基因靶向位置

  • 通过Sanger测序，确认目标基因靶向位置序列信息准确

  • 根据每个目标基因的靶向突变位置，设计并体外合成4条不同的sgRNA

  • 制备Cas9 mRNA或蛋白质

  • 鉴定所制备的4条sgRNA是否具有在斑马鱼胚胎内引导Cas9切割目标基因的活性

  • 将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA（或蛋白质）共同注射斑马鱼受精卵

  • 待注射胚胎生长至6 hpf后，随机选取5枚胚胎，确认Founder胚胎细胞携带目标基因突变的等位基因

  • 将经注射的受精卵饲养至45-60日龄时，通过对尾鳍的基因组鉴定确认Founder（F0）体细胞携带目标基因突变的等位基因

  • 获得F0的后代F1代

  • 至45-60日龄时，通过剪尾鳍的方法进行基因型鉴定，筛选F1个体，获得基因敲除突变体

• 乙方为甲方提供的最终服务产品

  • 提供可有效识别  基因的靶向突变位置基因组序列的sgRNA不少于1条

  • 提供携带   基因靶向突变的杂合子（当纯合突变不致死时，可能是两个等位因均突变的纯合突变子）斑马鱼（不小于1月龄） 3 尾（基因型可不相同）。

2.3上述突变体中，目标基因的突变应在外显子所在区域，位于起始密码子后，其突变类型为插入或缺失（Indel）突变，且应是移码突变，导致目标基因编码序列出现提前的终止密
码子,预期编码一个截短蛋白；或者，突变的位置由客户指定，经乙方认定可行后，实施靶向改造，造成插入或缺失（Indel）突变。
2.4提供上述突变的目标基因等位基因的基因型（附有测序报告）；
2.5提供鉴定上述突变体的鉴定方法；

• 提供阶段性项目进展报告

• 提供上述基因靶向突变的斑马鱼突变体建立过程的技术服务项目总结报告。