2.3.色谱柱温度变化会导致保留时间的变化：每1°C的温度变化会引起1-3％的保留时间变化。如果不使用柱温箱（即“室温”条件），由于实验室温度的变化，温度通常会在日间（和夜间）循环（周期性）变化。
虽然在室内恒温器的测量下，实验室温度显示为恒定，但是HPLC系统的微观（微）环境可能会发生显著变化，尤其是当供暖或空调通风口直接吹向系统时，温度变化极为明显。
使用柱温箱可以避免色谱柱出现这样的温度问题，且HPLC系统应远离通风口放置。
2.4.流量（流速）问题可能是因存在气泡、泄漏或泵问题（故障）导致的。
气泡问题应和低压（或脉动压力）以及保留时间的增加相关（可能伴有柱压过低或柱压波动，且保留时间延长）。
对于双头泵，如果只有一个泵头存在气泡，则流量和压力可能会发生脉动（跳动）。
应对流动相进行脱气，然后打开放气阀清空泵，并向泵中多次加入5-10mL的流动相，以正常流速流经泵，从而排出气泡（打开排气阀以正常流速的几倍泵入5-10ml流动相经过泵，以排出气泡）。
在某些情况下，可能需要使用低粘度的脱气溶剂，如甲醇（MeOH）或乙腈（ACN）来清除泵中顽固的气泡。
泄漏也会延长保留时间。配件（接头）上的滴水配件或玻璃体内的结晶沉淀都是泄漏的证据（查看接头如有液滴或结晶析出，可证明有泄露）。
请特别注意色谱柱上游的配件（之前的接头）。
自动进样器内的配件和密封件（接头和密封圈）可能难以检测，可借助手电筒和小镜子进行检查。
如果使用不锈钢配件，通常1/4的紧固螺母（将接头螺好再拧紧1/4圈）便可以阻止泄漏。
使用PEEK配件（接头）时，应停止泵，松开接头，将管子推到配件（接口）端口的底部，然后在重新启动泵之前拧紧配件（接头）。
拧紧PEEK配件（接头）时如果存在流动的液体，会导致管道在配件中滑动，产生柱外死体积，进而影响分离效果。
存在缺陷的止回阀（单向阀）或磨损的泵密封件（圈）会导致流量偏低或波动。
止回阀（单向阀）出现问题将导致压力的波动。如果在清除泵中气泡后还无法改善压力波动的情况，则止回阀（单向阀）可能存在故障。
可以更换新的止回阀（单向阀）；也可以将止回阀（单向阀）放置在（装有）MeOH的烧杯中，对其进行超声处理，以实现有效的清洁。
如果无法有效区分入口端和出口端之间的止回阀（如不易分清入口单向阀和出口单向阀），请划线标记或用标签标记烧杯。将每个止回阀（单向阀）放入单独的烧杯中进行清洁，使其分开清洁。如果部件滑出，应小心组装，以免受到污染（无尘手套，避免划伤部件等）。
随着使用时间的增加，泵密封件（圈）会出现磨损；而且使用缓冲流动相或将其置于高盐条件下（例如离子交换法），会缩短它的使用寿命。
您可以建立一个预防性维护计划，定期更换密封件并做相应记录（准确记录更换密封圈的时间间隔，就可以建立预防性的维护计划），从而在故障发生前更换密封件。如果无其它指标（征兆），应至少每年更换一次密封件（圈）。
2.5.比例阀和在线混合发生故障会降低梯度洗脱的效果（使梯度洗脱效果变差）。
图6示例显示了两次连续注射肽样品的梯度洗脱分析。在这种情况下，系统适用性测试允许两次运行之间存在0.1分钟的变化（保留时间变化）；第一个峰值不符合该标准，最后一个峰值勉强通过而中间两个峰值明显超出规定值。
图6. 两个连续梯度运行的（两次连续梯度洗脱）色谱图显示了梯度中点附近的峰形具有较大的误差（保留时间的误差较大）（13分钟）。来源[3]。
下面介绍了一种检查流动相配比（混合）精度的简单方法。
将柱更换为0.005英寸直径约1米长（0.12mm）的管道（取下色谱柱，换上长约1米，内径0.005英寸（0.12mm）的管路），在A容器中加水，且B容器中放有含有0.1％丙酮的水，将检测器波长设置为265nm，并使用足够高的流速使止回阀（单向阀）能够有效工作（例如2mL/min）。
以10％为增量运行一系列梯级（梯级实验）（10％、20％、30％……90％、100％B）。
由于问题经常出现在50％B附近，所以在45％B和55％B处增添了额外的梯级。
其结果应是平滑的阶梯状（参见图8a）。
对于图6的样品，在40％-60％B的梯级中观察到图7的曲线。
梯级是扭曲的（已变形），且45％到50％B的梯级（梯级变化）是8.4％而不是5％。
图7中的虚线近似于（拟合了该）梯度，同时（在）45％和50％B之间存在偏移。
因此，此处应是由具有较大保留变量的峰被洗脱导致的（不幸的是，这正是那些保留时间偏差较大的峰出峰的位置）。
HPLC系统可对比例阀进行调节。
当执行此操作时，梯级会变得平滑且保留时间也会处于规格范围之内。
图7. 在图6的梯度中点附近执行配比（比例）阶梯测试的结果。理论值显示在括号内。来源[3]。
如果系统性能良好，其阶梯测试的结果应与图8a类似，在整个图中呈现阶梯状。
未注射的0-100％B梯度是应运行的对比测试（另需同时进行一无进样的0-100%B梯度试验）。
它应显示为线性基线、线性梯度部分和线性后期梯度保持，每个部分之间均是平滑的曲线过渡（线性梯度部分以及一段梯度升高后维持直线，每两段之间为平滑曲线过度）。
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