原理
等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离的技术，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。
等电聚焦中，只有在凝胶两端给以高电压时，才能获得较好的蛋白质条带分辨率，这就需要非常有效的凝胶冷却系统（否则会导致烧胶），即凝胶同期周围液体之间的热传递效率要高。由于平板胶热传递能力高，并可方便的同时比较多种蛋白质样品，所以平板胶用在等电聚焦上的居多。
由于等电聚焦对蛋白质的电荷差异非常敏感，若要好的重复性，制备蛋白样品时一定要小心，要避免任何对蛋白质化学组成和结构的修饰。另外，蛋白质－脂类、蛋白质－蛋白质相互作用可引起电荷改变，进而导致等电点迁移或纹理现象。除非特殊需要研究蛋白质－蛋白质相互作用或者必须保持蛋白质的生物学功能，等电聚焦通常在含有尿素的变性凝胶系统中进行。使用非离子去垢剂也可以提高分辨率。
2.主要仪器、试剂
仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器
试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。
储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；
3.载体两性电解质的选择
载体两性电解质是一些具有相近等电点的分子量为600－900Da的多氨基多羟基两性化合物的混合物，下面时配置不同pH范围等电聚焦凝胶的载体两性电解质的配方：
4.灌胶
以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。
水：5.4ml； 储存液1）：2.0 ml； 载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl； 载体两性电解质溶液pH4-6 240μl； 超纯尿素 6.0 g ；10％过硫酸胺25μl； TEMED：20μl
灌胶步骤：1）组装灌胶器；2）将尿素、水、溶液1）和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；3）加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；4）将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；5）插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；6）聚合约1小时；7）聚合完成，小心拔去梳子；8）将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。
注意：1）上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；2）现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）。
样品制备和上样：
一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔大上样量大约15μl。
变性凝胶上样缓冲液2×Buffer（适用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10载体两性电解质：20μl；3）pH4-6载体两性电解质：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）2－巯基乙醇：50μl；双蒸水：1.7ml；1％溴酚蓝：200μl
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