RNA荧光（RiboGreen）定量检测试剂盒使用说明

主要用途
 
RNA荧光（RiboGreen）定量检测试剂是一种旨在通过使用RiboGreen荧光染料与样品中RNA的高度结合而产生荧光信号来精确定量样品中RNA含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种分子生物学实验，例如体外转录RNA、Northern Bolt、S1核酸酶检测、RNA酶保护检测、cDNA库制备、逆转录PCR和差异显示PCR中RNA含量分析。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，高度敏感。
 
技术背景
 
作为RNA染色剂之一的RiboGreen荧光染料与样品中RNA，包括rRNA、mRNA等结合，产生荧光信号。RiboGreen技术可以检测到低达1纳克RNA的变化。RNA的微量增加引起荧光信号强度（Intensity）或相对荧光单位（RFU）的显著增加。其自发荧光（Autofluorescence）忽略不计，重复性标准差异（Standard Deviation）低，不受样品化学成分的干扰。
 
产品内容
 
染色液（Reagent A）     15微升
稀释液（Reagent B）      5毫升
标准液（Reagent C）         200微升
产品说明书                          1份
 
保存方式
 
保存染色液（Reagent A）和标准液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里，染色液（Reagent A）避免光照，有效保证6月
 
用户自备
 
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析
 
实验步骤
 

• 测定准备

• 准备好待测样品，置于冰槽里

• 设定好荧光分光光度仪：激发波长485±10nm，散发波长530±12.5nm，并置零

• 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent A）置于冰槽里融化。然后移出500微升稀释液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入2.5微升染色液（Reagent A），混匀后，用锡纸包裹，标记为染色工作液（5次测定量），放在暗室里。然后进行下列操作。

• 构建标准曲线

• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

• 分别加入100微升稀释液（Reagent B）到每个离心管

• 移取100微升标准液（Reagent C）到1号管，混匀

• 小心移取100微升1号管稀释的标准液（Reagent C）到2号管，混匀

• 小心移取100微升2号管稀释的标准液（Reagent C）到3号管，混匀

• 小心移取100微升3号管稀释的标准液（Reagent C）到4号管，混匀

• 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管含量见下表

• 移取100微升含有染色液（Reagent A）和稀释液（Reagent B）的染色工作液到新的比色皿

• 加入100微升上述配制的标准液

• 室温下，孵育5分钟，避免光照

• 即刻放进荧光分光光度仪测读：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）

• 重复实验步骤8至11四次

• 绘制标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位（RLU）；横坐标（X轴）为DNA含量（微克/毫升）

• 样品检测

• 移取100微升含有染色液（Reagent A）和稀释液（Reagent B）的染色工作液到新的比色皿

• 加入100微升待测样品

• 室温下，孵育5分钟，避免光照

• 即刻放进荧光分光光度仪测读：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）

• 根据标准曲线获得样品对应RNA含量（微克/毫升）

 
注意事项
 

• 本产品为25次操作，包括标准曲线测定

• 整个操作须带手套，建议使用滤芯枪头，并格外小心，防止降解RNA

• 建议所有的操作用品属于RNA专用

• 使用新鲜配制的染色工作液，务必不要超过2小时，且注意避光

• 孵育时，避免光照

• 系统检测，标准曲线测定1次即可；如果仪器更换，则需要重新测定1次

• 如果荧光读数过高，可以相应稀释样品量

• 盐类、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白、琼脂糖不会干扰检测

• 如果样品中含有DNA，建议使用5单位DNA酶，37℃孵育90分钟预处理