烟草花叶病毒（TMV）ELISA检测试剂盒使用说明

检测原理

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被烟草花叶病毒（TMV）捕获抗体的包被微孔中，依次加入阴性对照、阳性对照、样本、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的烟草花叶病毒（TMV）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），判断样品是否含有烟草花叶病毒（TMV）。

样品收集、处理及保存方法

1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3. 细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

• 酶标仪（450nm）

• 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

• 37℃恒温箱

操作注意事项

1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3. 预处理后的样本无需稀释，直接取10μL加样即可。

4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5. 所有液体组分使用前充分摇匀。
   

试剂盒组成

试剂的准备

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

2. 自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
   

操作步骤

• 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

• 设置阴、阳性对照孔和样本孔，阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照各50μL；

• 待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

• 随后阴、阳性对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

• 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

• 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

• 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

1.  试验有效性：阳性对照孔OD值平均值≥1.00；
            阴性对照孔OD值平均值≤0.15。

2.  临界值（Cut off）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15

3.  阴性判断：样品OD值＜临界值（Cut off），样品为阴性

4.  阳性判断：样品OD值＞临界值（Cut off），样品为阳性

试剂盒性能

• 准确性：阳性对照孔OD值平均值≥1.00；阴性对照孔OD值平均值≤0.15，说明试验结果有效。

• 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

• 重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

• 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

• 有效期：6个月