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胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度。
抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间。
1）酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。
2）目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定。
3）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量。
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