上述的代谢法均属于酶标仪光吸收应用，虽然相对经济，但还是会受到光吸收本身的多种限制，尤其是动态范围窄，容易受到具有光吸收特性的试剂和药物干扰等。同时，光吸收法受限于比尔定律中的光径因素，不适用于384或1536孔板等更高通量检测等。因此，基于荧光检测的代谢法也成为了主要的细胞活力检测方法之一，其中常见的是基于刃天青还原的alamarBlue法。
原理上alamarBlue法与MTT和CCK-8法类似，利用增殖中的细胞固有的代谢能力进行还原无色，无荧光的刃天青，所得的红色产物resorufin具有强荧光特性，因此可用支持荧光或光吸收的酶标仪进行检测，提升了检测的灵活性和抗干扰能力[图三]。支持荧光检测的alamarBlue法可具有3-4个动态数量级，具有更宽的检测范围和更高的灵敏度。同时，还原产物可溶于水，低毒，因此和CCK-8一样支持动力学检测和多重检测。然而，alamarBlue法更为稳定，因此非常适合追踪细胞的增殖变化。
图三，alamarBlue反应前后的荧光(左，530-560 nm 激发)和光吸收变化(右)，图片来自于Invitrogen 技术材料
2.1.2 Molecular Devices的支持
针对于代谢法MD主要提供硬件和软件的支持，其中，硬件上配备光吸收的单功能和多功能酶标仪，如cMAX plus，Spectra-Max
M系列等都支持MTT法和CCK-8法的高通量检测。对应的，具有荧光检测功能的酶标仪，如SpectraMax iD3/5，SpectraMax
Gemini EM，SpectraMax i3X和M系列都推荐用于荧光法细胞活力检测。软件上，一方面Softmax Pro 7
模板库中的Cell Growth
&Viability已经预设了一些常用的方法模板，如alamarBlue法和MTS法。类似的方法只需在预设的模板上改变检测参数即可，同时，修改后的模板可另存为新的模板方便后续的检测。另外一方面，软件支持多种形式的数据处理，包括双波长矫正，空白扣除，数据均一化到后期的线性、四参数拟合等等，极大的简便了分析过程，提高分析效率和一致性。
2.1.3 常见实验流程和注意事项
代谢法的实验流程基本一致，以MTT法为例[图五]，主要分为以下几个步骤。
a) 预铺细胞于96孔板中，细胞密度需要根据细胞系本身和实验目的(增殖活力还是药物毒性筛选)进行优化。一般来说，悬浮细胞的密度要高于贴壁细胞。板型上光吸收法推荐透明板，荧光法推荐黑边底部透明板。
b) 按照需求进行化合物或类似处理，此步的实验需要优化药物的起始处理时间和孵育时间，留意代谢法需要细胞代谢加入的底物，因此需要维持细胞在增殖阶段进行下一步染色。此步中还需要留意对照的选择和设置，包括系统对照（只有细胞或只有MTT染料加药物等）和阳性对照(细胞毒实验中溶剂处理组等)。
c) 进行底物孵育，此步需要优化底物孵育的时间和浓度。留意荧光法此步注意避光。
d) 溶解反应出的结晶，此步需要确保结晶的完全溶解，同时要确保溶解产物不影响最后的检测，通常酸化的溶解会避免酚红对最后检测带来的影响。CCK-8法和alamarBlue法无需此步
e) 应用酶标仪进行单波长或者双波长检测。一般MTT法单波长为570 nm，双波长为 570 nm-630~690 nm 检测，用于矫正细胞碎片或浊度干扰[图五]。如果是荧光法，则按照推荐参数进行荧光检测。CCK-8法和alamarBlue法此步可按需求进行动力学检测。在进行动力学检测时，推荐酶标仪先预热至37°C。
处理和分析结果，相关的双波长矫正，均一化和线性/四参数拟合等可在Softmax Pro软件中自行完成。
代谢法的底物都是通过还原反应进行检测，因此会受到具有还原能力的化合物和试剂的影响。此外，具有光吸收属性和荧光属性的化合物可能会影响光吸收法，如MTT法和CCK-8法和荧光法如alamarBlue法的检测结果。对于上述影响，一方面可以通过直接混合化合物和底物检测排除，一方面可通过其他的细胞活力检测方法进一步分析。
2.2 酶法
2.2.1 原理和介绍
2.2.2 Molecular Devices的支持
2.2.3 常见实验流程和注意事项
2.3 ATP法
2.3.1 原理和介绍
2.3.2 Molecular Devices的支持
2.3.3 常见实验流程和注意事项
三、细胞毒性和杀伤分析
虽然上述的细胞活力分析方法被广泛的用于毒性分析，但其从细胞活性的变化为出发点，不是直接的分析细胞毒性，同时，随着免疫领域的兴起，越来越多的研究开始关注直接的细胞毒性，尤其是细胞裂解情况的检测。在此章中，我们会像大家介绍一些常见的，偏向由免疫细胞杀伤对应的毒性的检测。
3.1 LDH 细胞毒性法
3.2 Calcein 释放法
3.3 荧光素酶释放法
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