DNA快速检验全球研究进展（三）

芯片毛细管电泳具有进样量少，灵敏度高，分析速度快等特点，非常适合法医DNA-STR的快速检验。毛细管电泳芯片由于尺寸小，可施加较大场强，所以在几秒钟内就可完成对样品的分离，微阵列毛细管电泳芯片可实现高通量检测则成为目前学者研究的热点。2002年Emrich CA等[31]报道的将高通量384孔毛细管阵列微电泳芯片集成在半径仅为8 cm的圆盘上，7 min内实现了同时对384份样品的检测；2006年Yeung等[32]制作的高通量96孔毛细管阵列微电泳芯片可在30 min内同时实现96个样本检验，这些均进一步显示了微芯片技术在DNA-STR快速分析方面的巨大潜力和优势。为了防止样品间发生交叉污染，降低成本，可以构建一次性的塑料材质的微整列电泳平台。

集成式芯片是当前微流控芯片研究的核心，如Hagan等[29]将DNA提取和RCR扩增集于一块芯片上，通过采用固相提取，使用快速启动DNA聚合酶及红外加热方式，在45 min内完成了口腔拭子的提取和PCR扩增；Roux等[33]将芯片PCR扩增和电泳检测集成在一次性的塑料芯片上，通过非接触式红外加热方法仅在7 cm芯片上完成了电泳分离；季旭等[34]研制的一种集成PCR反应室与毛细管电泳CE的生物芯片，将硅片上制造的通过电阻加热的凹槽作为扩增池，在扩增池下游设计制造毛细管电泳系统，并通过紫外光等检测器判断结果，从而实现了样品扩增、电泳分离和紫外光检测的单片集成。Liu等[35]将特定DNA模板的纯化、PCR扩增、进样以及电泳全集成于一张微流控芯片上，并可在3 h内实现对样本DNA的检验（如图 3所示），该全集成芯片原理结构为两个完全相同的分析系统在4 in（1 in=2.54 cm）玻璃晶片上形成对称的双峰，每个分析系统包括聚二甲基硅氧烷（PDMS）微泵和两个PDMS微型阀用于流体控制，首先通过4 cm长的珠捕获结构用于DNA分叉通道系统模板的捕获。图 3（b）为加热器和电阻温度检测器（RTD），用于控制250 nL PCR室的扩增。图 3（c）为500 mm长的双T通道锥形结构，用于控制PCR的纯化和进样，24 cm和14 cm长的通道用于CE分离，同时这两个系统共享阳极、阴极，进一步节省了芯片的使用空间。文献[36]在2014年将全集成芯片技术成功应用于对模拟犯罪现场样本检材的检验。全过程包括制备特殊酶的反应液用于DNA的提取，采用红外非接触式控温技术完成PCR扩增和高分辨的电泳分离方法在2 h内完成了对样本的准确分型，并与传统方法分型结构一致。

4.2 芯片化法医DNA检测的实现方式

4.2.1 微流控芯片DNA提取条件的优化

对提取进液量进行筛选，包括提取过程中的水，NaOH，HCL以及最后冲洗的水和TE缓冲液的体积，通过控制变量法，分别设置不同的体积梯度和停留时间，进行自动化提取，按照正常的扩增体系，并同时设置阳性对照和空白对照进行比较确定出最佳进液量；对于提取进液的管道可以设置多种不同的长度并运行自动化提取流程，提取后取出芯片上的载体物质进行常规的PCR扩增并检测，通过比较不同长度管道的扩增效果确定出最佳管道长度。

4.2.2 微流控芯片PCR扩增与优化

对芯片PCR材料进行生物相容性验证是芯片PCR正常扩增的前提，因为一般芯片的结构是两种以上的材料通过键和组成，在此过程中可能会有抑制物释放出来从而影响后续的PCR扩增。直接将芯片的原材料剪取小块，放入扩增体系，加阳性标准品，扩增检测，同时设立不添加原材料的阳性对照，3个重复；分别用高温浸泡的芯片材料和去离子水配置PCR反应体系进行扩增检测，同时设置正常去离子水为阳性对照，3个重复；用去离子水冲洗键合芯片材料3次，配置PCR反应体系进行扩增检测，同时设置正常去离子水为阳性对照，3个重复；对提取装置最后的冲洗水进行研究，配置PCR反应体系进行扩增检测，同时设置正常去离子水为阳性对照，3个重复，对以上结果进行比较，如果荧光信号基本无差异则相容性良好。

微流控芯片PCR的实现重点在于对芯片材料属性的研究和芯片扩增体系的优化两部分。首先了解芯片的基本结构，一般芯片腔室的实际温度和PCR扩增仪显示的温度有较大差别，所以需进行芯片温度校准，以保证规定时间内有足够的退火温度和延伸时间；由于芯片材料的不同，即使对芯片PCR没有抑制作用，但是由于芯片比表面系数的增加，对蛋白酶的吸附逐渐增加，以及载体的存在，吸附会更明显，所以通常对芯片进行预处理，使内壁和反应体系隔绝，可以采用一定浓度的BSA、PEG进行芯片涂布预处理。微流控芯片对PCR某些成分的吸附，会影响PCR的扩增效果，通过对扩增体系中不同反应液的分析和浓度调节，尽量改善扩增效果。采用控制变量法，分别对不同成分设置浓度梯度，进行扩增检测，并且同时设立常规检测进行比较；操作者可在扩增体系中加入不同浓度梯度的BSA、PEG，并设立常规阳性对照，3个重复进行比较，从而确定出最佳扩增体系。

4.2.3 毛细管芯片电泳系统的优化

根据毛细管电泳技术的基本原理，影响电泳的因素主要有电场强度、毛细管的材料和内壁、缓冲液的成分、溶液的pH值和浓度、温度等。对于电泳筛分介质的制备，参考已有成果制作筛分介质并同时选择3种商品化的筛分介质进行比较；对于管道表面修饰，参考已有研究成果进行动态涂布、静态涂布处理，填充自制的筛分介质后备用。芯片毛细管电泳实验采用悬浮式的进样方式，参考已报道的研究成果，选取合适的电压、时间、光信号进行电泳检测。

5 全自动DNA分型检测设备

近几年，国外相继有3种全自动DNA分型检测设备上市（见表 2）。2013年美国IntegenX公司全球首家推出RapidHIT200 DNA快速检测仪，针对唾液、血液、血斑、唾液斑等样品，通过选用Promega PowerPlex 16HS试剂，分型成功率均在89%以上，并且可在现场90 min内快速完成DNA检测[37-38]，并且输出的结果可与CODIS及中国DNA数据库比对。2016年最新升级的RapidHIT200 DNA快速检测仪与GlobalFiler Express试剂相结合，可同时检测7个样本。文献[39]用150份口腔样本进行验证，进一步说明了检测准确率更高，设备灵敏度高（从6 260个细胞中获得37.5 ng DNA）。DNAScanTM快速检测设备是美国多政府部门合作在法律部门，刑事实验和生物测定实验室推行快速DNA检测技术项目（Acceleted Nuclear Equipment，ANDE）研究成果之一。该快速设备使用一体化BioChipset试剂盒，在85 min内同时完成5个单一来源样本的DNA检测，符合美军用810F耐用标准，并且通过冲击试验、振动试验、坠落实验及环境变化检测实验均证实该设备经久耐用。Tan E等[40]对该仪器设备的性能，检测的灵敏度等进行了进一步的验证。2014年，LGC法医刑侦科学协会成功研发的ParaDNA Screening快速检验系统可在75 min内同时实现对4个样本的DNA检测。

表 2商业化全集成DNA分析仪的比较

表选项

6 结束语

综上，缩短对样本DNA提取，扩增，纯化，电泳检测中任意环节所消耗的时间均可实现不同程度的法医DNA的快速检验。国内外成熟的方法是使用商品化的提取试剂，快速试剂，或是通过将快速试剂与性能好的快速扩增设备，电泳设备相结合来实现。但是本文认为直接PCR会因为样本中各种潜在的未知抑制物影响酶的活性，缺乏定量步骤会影响DNA的分型结果，所以使用商业化直扩试剂盒时，要严格按照试剂盒所规定的样本量进行实验。目前DNA-STR快速检验主要适用于常规检材，但对于一些疑难检材，混合样品，以及高度降解的检材的使用仍然是个严峻的挑战，但是要明确：快速检验的目的主要是协助公检法处理一些棘手和特殊的案件，如处理案件性质恶劣但必需在极其有限时间需要得到分型结果。虽然国外商业化的3种便携式的全自动快速检验仪器已经上市，但普遍存在的问题是检测成本过高，并且不能自主选择样本数，国内普及困难。全集成微流控芯片技术是目前快速检验研究的核心，即使芯片的适用具有一定的样本选择性，并且芯片结构复杂，成本高，但是国内的研究面临的主要瓶颈是如何开发配套的软件来分析自制的微芯片的电泳结果。法医DNA快速检验需从检测样本数目的自主选择、再检测样本能力以及疑难，混合样本的角度出发，研制出我国国产的便携式全自动快速检测仪器，并实现推广普及。

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