简介
药物有效性和安全性筛选成本的持续增加导致了对创新技术的需求，从而在药物发现过程中更早地进行表征和特性的检测分析。FDA正在制定化合物检测的指导方针，以确保药物的安全性，使得药物无需因为不良反应而撤市， 例如阻断心脏hERG通道，并导致像尖端扭转型室性心律失常这样的症状。这一方向被称为全面的体外心律失常试验或CiPA项目。诱导多能干细胞(iPSC)分化的心肌细胞因其用于评估对心脏功能和安全性的复合作用，在体外模型系统被广泛使用。钙信号振荡的结果可以反映细胞内钙离子浓度的变化， 从而可以使用钙敏感染料如EarlyTox™荧光染料试剂盒进行信号的检测。ScreenWorks®Pro软件可以分析心肌细胞跳动峰值的频率，峰值10%的振幅峰宽，以及其他参数以高通量筛选的方式来描述化合物影响心肌细胞。
干细胞公司CDI (Cellular DynamicsInternational) 已经开发了一种增强版的iPSCs分化的心肌细胞，其复苏后恢复的速度比之前版本的iPSCs更快。这样的改进使得在FLIPR Tetra 高通量实时荧光检测分析系统上检测化合物对跳动的心肌细胞钙瞬变信号影响的工作流程缩短生长时间5 - 7天。图1是示例的工作流程。本文中我们阐述了一些癌症化合物的检测，其中一些已知会影响hERG通道，其它化合物已知可以阻断hERG通道。
优势
• 缩短细胞培养时间，提高实验的工作流程和质量
• 在药物发现过程中更早地发现可能导致安全问题的化合物
• ScreenWorks Peak Pro软件简化数据分析
材料
• iCell® Cardiomyocytes2 试剂盒，包括细胞、铺板培养基和维持培养基 (Provided byCellular Dynamics, International)
• 0.1% (w/v) 明胶
• 384孔黑壁底透多孔板 (Corning PN 3712)
• EarlyTox 心肌细胞毒性检测试剂盒(Molecular Devices PN R8210)
• 测试化合物和DMSO (Sigma Aldrich)
• FLIPR Tetra 高通量实时荧光检测分析系统(Molecular Devices)
准备iCell心肌细胞多孔板
在iCell心肌细胞使用指南的指导下，用0.1%的明胶包被384孔黑壁底透多孔板。iCell心肌细胞复苏后以8000个细胞每孔的密度铺在每孔25μL的培养基中。细胞在37°C、5% CO2、以及100%湿度条件下培养24小时。细胞形成单层并更换成维持培养基。细胞每隔一天更换一次维持培养基。在第5天，细胞开始同步跳动并可以用于实验。
准备化合物板用于筛选检测
为便于筛选检测，化合物溶于100% DMSO配置成10 MM的母液。维持培养基稀释母液至10-100 μM的检测浓度。在使用FLIPRTetra系统检测前，提前24小时将稀释好的化合物溶液添加到每个孔中。DMSO在培养基中的最终浓度为0.15%(v / v)。浓度范围从30或100μM对数稀释的每个浓度的化合物进行两次(n = 2)或三次(n = 3)的检测。
使用FLIPR Tetra系统观察钙振荡
实验前24小时，以终浓度30μM开始的对数稀释的各种化合物加入到iPSC 心肌细胞中。检测之前两个小时25μL体积的溶于维持培养基的2倍浓度的EarlyTox心肌细胞毒性检测染料添加到每孔中，并在37°C、5% CO2条件下孵育。当细胞从培养箱取出后，钙离子浓度的变化会随着细胞的振荡而变化，从而引起FLIPR Tetra系统所记录的荧光信号的改变。在ScreenWorks工作软件中的实验方案和参数设置如表1所示。数据分析使用了ScreenWorks PeakPro软件模块，并在GraphPad Prism 6中绘制了图形。
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