使用中空纤维切向流过滤（HF TFF）优化高浓度抗体工艺-1

背景/介绍

抗体（Abs），或免疫球蛋白（Ig），被广泛用于许多不同的科研和治疗性应用¹。特别是，单克隆抗体（mAbs）在诊断、蛋白质纯化以及医疗应用中的使用显著增加^2-5。妨碍治疗性mAbs使用的一个主要障碍是皮下注射需要使用较高的浓度，因为这是优先选择的给药方法。按FDA要求，皮下给药时，注射体积应低于1.5ml，这就意味着，制剂的浓度需高于100mg/ml⁷。但是，如此高浓度的mAb制剂对生产来说会是不小的挑战，问题包括稳定性、溶解性、高粘度以及聚集^8,9。Ab制剂也会有相似的问题。

相比平板膜包过滤器，中空纤维切向流过滤（HF TFF）是高浓度Abs制剂制备的一种极佳的方法，因为纤维内腔呈现非湍流的流体动力学，获得显著更低的压力降。对于大多数使用膜包式TFF过滤器的高浓度Ab应用，需降低进样泵，以维持恒定的压力，因为抗体的粘度会不断增加。在HF TFF中，不需要控制进样泵，因为压力增加非常小。此外，使用HF 过滤器时，产物的收获和排空也非常简单，因其没有膜包过滤器通常使用的湍流促进器或筛网。最后，使用一次性HF 过滤器可免去繁琐的清洗、组装、拆装和维护步骤，最终节省传统膜包过滤器使用相关的时间和间接成本。

本应用测试了使用HF膜进行IgG有效浓缩的可行性，并分析了剪切率和跨膜压（TMP）对滤液通量的影响。

材料和方法

系统：KR2i TFF系统（SYR2-U20，SpectrumLabs.com）

过滤器：30kDa mPES，MicroKros（C02-E030-05-N，0.5mm；C02-E030-10-N，1.0mm，SpectrumLabs.com）

样品准备

IgG为商业化产品（Sigma Aldrich），溶解于0.9%盐溶液，至终浓度30mg/mL。实验运行前，溶液使用0.2μm过滤器过滤，去除较大的颗粒。

IgG起始和终浓度使用280nm吸光光度法检测，使用Beer法则计算浓度。ε280=210,000M^-1cm^-1。

过滤器组件准备

浓缩实验前，过滤器组件润湿，并测试完整性。MicroKros过滤器组件截留分子量（MWCO）为30kDa，含改性聚醚砜（mPES）纤维，在本应用笔记中，实验使用纤维内径（ID）为0.5mm（每根组件含6根纤维，20cm²）或1.0mm（每根组件含2根纤维，13cm²）的组件。组件润湿及完整性测试使用KR2i TFF系统进行。简单来说，过滤器组件用DI水冲洗，直至每cm2表面积滤液体积为2ml。使用泄漏实验，测试纤维和组件完整性。组件完全润湿，纤维外腔（ECS）用水完全浸没。回流端关闭，通过入口，向组件内缓慢导入空气。当跨膜压（TMP）达到~0.5psi时，停泵。ECS内无气泡，且进样压力恒定，说明为完整过滤器组件。完整性检查后，使用0.9%盐溶液润洗过滤器，直到收集到2mL/cm²的滤液。

浓缩实验

浓缩实验使用KR2i TFF系统进行。实验使用纤维内径0.5和1.0mm的HF膜，剪切为6,000S^-1。使用整合式KF Comm软件采集数据（流速、压力等）。IgG溶液（30mg/mL）加入锥底容器（含3导管盖，SpectrumLabs.com）。滤液管路连接至收集容器。浓缩过程通过测量收集的滤液的质量来监测，由KF Comm软件自动检测。在3秒钟内，缓慢增加泵速，至所需流速（6,000S^-1剪切），将蛋白溶液泵入组件。KR2i系统设置为浓缩（C）模式。

剪切率实验

为测试不同剪切率对滤液通量的影响，将IgG溶液（~100mg/mL）循环通过HF膜。为保证整个工艺过程中，IgG浓度恒定，IgG溶液用0.9%盐溶液连续洗滤。系统设置与C模式一致，但将锥底样品容器的第3根导管连接至装有缓冲液的辅助容器，而不是连通空气。流路通过工艺过程中形成的真空，向IgG溶液中连续添加缓冲液，速度与滤液流速一致。剪切率实验以可提供适当剪切率的流速进行，不施加背压。实验使用含0.5和1.0mm内径HF膜的过滤器组件进行，数据采集使用KF Comm软件。

跨膜压（TMP）实验

通过在恒定剪切率条件下，向回流管路施加背压，测试跨膜压（TMP）对过滤器性能的影响。实验使用含0.5和1.0mm内径HF膜的MicroKros过滤器组件进行。实验使用剪切率6,000和10,000S^-1。实验设置与剪切率实验相似，只有一个需要注明的不同。按浓缩/洗滤（C/D）模式，使用一个二级洗滤泵向蛋白溶液中连续补加缓冲液（0.9%盐），以在整个实验过程中，维持恒定的30mg/mL的IgG浓度（浓缩因子设置为1，以使洗滤立即开始）。数据使用KF Comm软件采集。

结果和讨论

浓缩实验（0.5mm内径）

起始实验中，我们使用HF膜测试了IgG可被浓缩的最大限度。使用含0.5mm内径纤维的MicroKros组件。实验中，将20mL 30mg/mL的IgG溶液（0.9%盐溶液）置于50mL含3导管盖的锥底工艺容器中。2根导管分别连接至组件的进样和回流管路，第3根导管连通空气。

滤液管路关闭，IgG溶液缓慢泵入管路和组件。当循环流速恒定后，打开滤液管路，开始浓缩。在此实验中，不施加外部背压（通过回流管路），所以，随溶液浓度增加而导致的粘度的增加，TMP增加。进样流速27mL/min（6,000S^-1剪切）也保持恒定。

图1.使用含0.5mmID mPES HF 膜的MicroKros组件进行高度浓缩实验时的通量、TMP、压力降（DP）和浓缩因子（CF）数据。

如图1所示，浓缩开始后，TMP立即开始增加。同时，通量开始稳定下降。组件两端的压力降（DP）可作为膜污染的指示，通常是涉及浓缩步骤的工艺的困扰。但是，图1显示，即使在工艺开始60min后，压力降维持在10psig以下。60min之后，压力降开始增加超过10psig，最终达到约25psig，通量降至0L/m²/hr。

使用UV-分光光度法确定IgG溶液的最终浓度，约为350mg/mL，相当于浓缩~12x。

浓缩实验（1.0mm内径）

我们也使用含1.0mm纤维内径HF膜的过滤器组件进行了浓缩实验。该工艺的剪切率保持恒定，为6,000S^-1（71mL/min。）TMP通过自动背压阀控制，维持为5psig。结果如图2所示。

图2. 使用含1.0mm ID mPES HF膜的MicroKros组件进行浓缩运行时的通量、TMP、DP和CF数据。运行过程中TMP保持恒定为5psig（除最后数据点）。