使用串联切向流过滤高效浓缩慢病毒载体

2020.5.05

王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

简介

VSV-G-假型自我灭活慢病毒载体是不可或缺的生物实验工具之一，与之前的γ-逆转录病毒载体不同的是，慢病毒载体可转导非分裂细胞，并可携带更多的转基因盒，在细胞中的转基因表达时间也更长，即可获得更高的滴度，而其遗传毒性相对较低。

一般情况下产毒细胞上清液中的载体滴度足以转导常规细胞系，但原代细胞较难转导，需要进行载体浓缩以获得较高浓度。此外，一些载体因整合了会降低滴度的遗传元件，且大多数细胞类型也不耐受产毒细胞生长培养基或其分泌蛋白，所以浓缩及清洗是慢病毒载体使用的必要步骤。

超速离心是病毒颗粒浓缩的常用方法之一，但其浓缩系数较低，每次处理量也偏小，且繁琐的多步操作会降低病毒颗粒回收率。离心过滤是相对较简单的浓缩方法，但过滤器本身会捕获截留大量载体，造成损耗。相较而言，切向流过滤（TFF）操作简单，损耗低，且可通过洗滤过程有效降低产毒细胞代谢物及分泌蛋白，但传统的一步式TFF浓缩程度仅可达50-100倍，本实验使用两步TFF，成功将5.5L 慢病毒载体原液浓缩至1mL左右，且回收率高达97%以上。而对终产物的质量分析显示，浓缩的慢病毒载体可有效转导原代人CD34+造血干/祖细胞和原代人纤维母细胞，且无明显毒性。

实验

实验使用含pCCL载体质粒、gag/pol表达质粒及囊膜表达质粒pMD.G（VSV-G）的转染混合液转染293T细胞，并于转染后进行丁酸钠诱导，培养一定时间后，分两次回收含LV培养基，过0.8μm过滤器，滤液保存于无菌容器。

切向流过滤使用KrosFlo研发用IIi切向流过滤系统（产品编号：SYR2-U20-01N），第一步操作时，系统配用流路1（FP1，产品编号：EZ-M1-500S-260-01N-1，含500kD中空纤维过滤器（纤维数量320，纤维内径0.5mm，膜表面积615cm2）），第二步操作时，系统配用流路2（FP2，产品编号：EZ-CHIL07-01-1，含500kD中空纤维过滤器（纤维数量12，纤维内径0.5mm，膜表面积40cm2）。

过滤前先检查流路（FP1）完整性，用DPBS完全润湿流路后，运行系统，直到DPBS排干，关闭端口和阀门，运行泵，直到入口压力达到5psi左右，打开滤液端口，由于空气不能渗过润湿的过滤器纤维，如组件完整，则压力降不应超过0.01psi/s。

通过完整性测试后，开始浓缩含LV培养基。整个过程中，监测入口压力，并维持为6psi以下。第一步操作可将5.5L料液浓缩至50mL，即浓缩100倍左右。浓缩的载体再用1000mL含胎牛血清的洗滤缓冲液进行恒量洗滤。之后，将系统流路更换为FP2，通过完整性测试后，将第一步获得的50mL浓缩液进一步浓缩至1mL，即总浓缩达5000倍。该步入口压力维持为9psi以下
随后，通过HT-29细胞载体转导实验确认滴度，并使用多重实时PCR技术进行绝对定量分析。同时，以终浓度载体转导原代人CD34+造血干/祖细胞，确认浓缩后载体的转导效力。此外，构建针对诱导多能性干细胞（iPSC）生成的复合STEMCCA 载体，以相同的方法进行浓缩，检测其转导和重编程原代人纤维母细胞的能力。

结果

使用TFF进行LV浓缩可获得极高的浓缩系数和回收率，且对浓缩后LV的冻融实验显示，终产物具有良好的稳定性。

为测试浓缩LV的质量，进行了原代人CD34+造血干/祖细胞的转导实验，结果显示，转导非常成功，且随载体浓度的增加，转导成功率亦明显上升，而无明显毒性。而在原代人纤维母细胞转导实验中，含有高效STEMCCA元件的载体可有效转导并重编程原代人纤维母细胞，形成诱导多能性干细胞，且成功率随载体浓度增加而提高。