人甲羟戊酸激酶 (MVK) 酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用...

人甲羟戊酸激酶 (MVK) 酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用

目的：本试剂盒用于测定人血清，组织及相关液体样本中人甲羟戊酸激酶

(MVK) 含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人甲羟戊酸激酶 (MVK) 水平。用纯化的人甲羟

戊酸激酶 (MVK) 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入甲羟戊酸

激酶 (MVK) ，再与 HRP 标记的甲羟戊酸激酶 (MVK) 抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗

体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在

酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的甲羟戊酸激酶 (MVK) 呈正相关。用

酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人甲羟戊酸激酶

(MVK) 浓度。

试剂盒组成：

试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置 保存

说明书 1 份 1 份

封板膜 2 片（48） 2 片（96）

密封袋 1 个 1 个

酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存

标准品：450pg/mL 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存

标准品稀释液 1.5ml×1 瓶 1.5ml×1 瓶 2-8℃保存

酶标试剂 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

样品稀释液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

显色剂 A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

显色剂 B 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

终止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存

浓缩洗涤液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上

清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择 EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，

离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再

次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中

如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/

分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓

度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟

左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备

用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将

标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，

其余冷冻备用。

操作步骤

1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在第一、第二孔中分别加标

准品 100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50μl，混匀；然后从第一孔、第二

孔中各取 100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μl，

混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 弃掉，再各取 50μl 分别加到第五、第六孔

中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各

取 50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl，混

匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准

品稀释液 50μl，混匀后从第九第十孔中各取 50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50μl，

浓度分别为 300 pg/mL，200 pg/mL ，100 pg/mL，50 pg/mL，25 pg/mL）。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样

品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待测样品 10μl（样

品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混

匀。

3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

4. 配液：将 30（48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30（48T 的 20 倍）倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此

重复 5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。

7. 温育：操作同 3。

8. 洗涤：操作同 5。

9. 显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

15 分钟.

10. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止

液后 15 分钟以内进行。

注意事项：

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未

用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好

控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值

大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计

算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，

在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD

值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释

倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标

准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值

代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释

倍数，即为样品的实际浓度。

（此图仅供参考）

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.95 以上。

2.批内与批间应分别小于 9%和 11%