1、激光扫描共聚焦显微镜用途
激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。
2、激光扫描共聚焦显微镜基本原理
光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是一种高分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进行观察时，来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的一个点（焦点）进行成像，再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。在此过程中，来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。
共聚焦显微镜简化原理图
用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。
3、激光扫描共聚焦显微镜样品准备
1.提前将PBS放在37度水浴锅中。
2.将小皿从细胞培养箱中取出，弃掉培养液，用PBS洗2—3次，轻晃几下即可。注，此步加PBS时一定要轻一点，否则细胞会漂浮起来。
3.弃掉PBS后加1ml 4%多聚甲醛，固定细胞，室温静置30min。
4.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
5.弃掉后加0.1%Triton-X100 1ml，室温透膜静置15min。
6.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
7. 5%PBS脱脂乳，封闭1h，可在摇床上轻晃，也可以室温静置。
8.一抗1h，可在摇床上轻晃。
9. PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃
10.二抗1h。避光可在摇床上轻晃
11. PBS，1ml，3次，5min/次避光，可在摇床上轻晃
12.DAPI染色15min避光，室温静置
13. PBS，1ml，3次，5min/次，避光，可在摇床上轻晃
14.激光共聚焦显微镜观察。
4、激光共聚焦显微镜样品处理注意事项
1、盖玻片背景较脏可以使用弱酸浸泡，如稀盐酸。
2、盖玻片需要灭菌，比如紫外照射，两面都照射，然后放于合适的孔板中，接种合适密度的细胞于孔板中，一般较稀一些，那样容易有单个的细胞，得到较好的图片。
3、加抗体时最好能在封口膜上操作，那样很节约抗体，样品可以放到一个湿盒中，饭盒加水就可以了。一定要记住接种细胞的玻片面，别弄反了。
4、在载玻片加上一滴，防淬灭剂，用甘油配制的DABCO，将含细胞的盖玻片那一面朝向载玻片放置，周围再用指甲油或其它胶固定。用锡箔纸包住，避光4度保存，最多一个月。
5、最好染核，核好染，同时也便于观测。
6、先在普通荧光显微镜下观测你的结果，实验理想的话再去看激光共聚焦。毕竟激光共聚焦很贵。
首页
