引言
数据非依赖采集（Data-Independent Acquisition, DIA）是当前最热门的质谱采集技术之一，它以非目标的方式将质量范围分为若干窗口，依次并循环采集窗口内所有母离子的二级碎片[1,2]。DIA 与 SRM 类似，也是基于子离子（transition）定量，相比传统蛋白质组学定量方法具有更好的选择性和更高的准确度。然而，目前DIA在翻译后修饰分析上仍有较大瓶颈。DIA 依赖于 DDA 建立谱图库，而 DDA 数据在搜库鉴定时，修饰位点定位错误的概率较高，特别是磷酸化修饰发生在常见的 S/T/Y 上，若肽段含有 2 个或以上位置接近的 S/T/Y，位点就容易找错。将含有错误位点信息的鉴定结果作为谱图库，就会导致翻译后修饰 DIA 解析结果的不可靠[3]。因此，DIA 尚难用于大规模的翻译后修饰样本分析。
针对修饰位点的打分算法使修饰位点的定位更加准确，Proteome Discoverer 软件中整合的 phosphoRS/ptmRS 模块[4]和 MaxQuant 软件的算法[5]都可以实现位点可信度（Site Probability）的计算，从而获得可靠的位点定位信息。本文基于上述软件对翻译后修饰 DDA 数据进行位点可信度分析，筛选具有准确位点定位的谱图建立谱图库，导入 Skyline 软件，进而实现可靠的翻译后修饰 DIA 解析。将该流程应用于磷酸化样本 DIA 数据分析，成功提取 6401 条高可信度的磷酸化肽段（Q < 0.01），占谱图库肽段总数的 98.4%，其中可用于准确定量的肽段（CV < 20%）占 86.9%，有效解决了翻译后修饰 DIA 定量的难题。
实验条件
实验材料和方法
来源于大鼠组织富集的磷酸化样本，最终上样量为 700 ng/run，分别进行 DDA 和 DIA 采集，每种采集模式重复 3 遍。
色谱条件
纳流高效液相色谱仪：EASY-nLC 1000（Thermo Scientific）
分析柱：纳流 C18 色谱柱（长15cm, ID 75 μm, 粒径3 μm）
流动相：A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液
梯度：0–3 min, 3–7% B; 3–95 min, 7–22% B; 95–113 min, 22–35% B; 113–116 min, 35-90% B; 116-120 min, 90% B
流速：300 nL/min
质谱条件
质谱仪：Orbitrap Fusion（Thermo Scientific）；
离子源：NanoFlex；离子模式：正离子；喷雾电压：1.8 kV；毛细管温度：275°C；S-Lens RF：60%
DDA：分辨率：一级120,000@m/z 200，二级30,000@m/z 200；AGC：一级2e5，二级5e4；二级Maximum Injection Time：100 ms；碰撞能量：HCD 30%
DIA：质量范围：m/z 400–1200；窗口：25 m/z（窗口间 1 m/z 重叠，实际 Isolation window 设 26 m/z）；二级分辨率：30,000@m/z 200；二级AGC：1e5；二级 Maximum Injection Time：85 ms；碰撞能量：HCD 30%；每个 DIA 循环之间插入一次一级扫描。
数据处理
基于 Proteome Discoverer 2.0 软件进行 DDA 鉴定、位点筛选和谱图库建立，Proteome Discoverer 1.4 和 MaxQuant 也可以实现相同的工作。
搜库鉴定参数：Uniprot 大鼠蛋白数据库，母离子质量偏差：10 ppm；碎片离子质量偏差：0.02 Da；固定修饰：C 烷基化（+57.021 Da）；动态修饰：M 氧化（M+15.995 Da）；S/T/Y 磷酸化（S/T/Y+79.966 Da）；酶：trypsin；Q 值（Percolator）：< 0.01；ptmRS 模块：PhosphoRS mode: True; Use diagnostic ions: True
位点筛选和谱图库建立：对 PSM 表格“Isoform Confidence Probability”一项进行筛选，保留 _ 0.75 的结果，导成 PepXML 格式，并将相应谱图导成 mzML 格式。PepXML 文件和 mzML 文件同时导入 skyline 建立高可信磷酸化肽段谱图库。
DIA 数据 Skyline 解析：根据 DIA 采集参数设置隔离窗口，将谱图库中所有肽段及相应蛋白作为 Targets，每个肽段选取强度最高的 6 个 b/y 离子进行峰抽提，提峰结果使用 mProphet 进行假阳性评估，控制 Q 值 < 0.01。
实验结果
1. 精确修饰位点谱图库建立与 DIA 解析流程
由于肽段中含有多个可能发生翻译后修饰的位点，如果不对可能发生修饰的位点进行可信度打分，会造成翻译后修饰位点的错误匹配和定位。将错误匹配和定位的翻译后修饰肽段作为谱图库，就会导致 DIA 解析结果的错误。这是目前翻译后修饰 DIA 分析的瓶颈所在。
基于 Proteome Discoverer 的 phosphoRS/ptmRS 算法能够对可能发生修饰的位点进行打分（Site Probability），判断定位的准确性。通常认为 Probability _ 75（100 分制）或 0.75（1 分制）的位点定位准确、可靠；具有多个修饰位点的肽段，其所有位点的 Probability 均 _ 75（或 0.75），则修饰位点及 isoform 唯一确定。通过这一方法，筛选出位点准确可信、isoform 唯一确定的 PSM（即 Isoform Confidence Probability 75（或0.75）建立谱图库，实现精确的翻译后修饰 DIA 分析。整个流程如图 1 所示。
图 1. 精确修饰位点谱图库建立流程图
首页
