图 17. TMT-标记的纯 E. coli 中的比值。预期比例用虚线表示。请注意对于 128/126 和 129/126 比例，方法 4 的定量分析准确度最高。
MS2 自动增益目标值（AGC）
自动增益目标值是需要设置的另一个关键参数，其大小决定了 C
trap 能积累并进入 Orbitrap 分析器中进行检测的最大离子数。虽然 S/N 和鉴定效率会随着离子数增加而增加，但偏高的 AGC
目标值设置会造成离子聚集或其他与空间电荷相关的问题。13 图 16 和 17 中比较了当进样量为 1 μg 时，AGC 目标值设置成 5e4 和
1e5 的定量结果差异。当该参数设置为 1e5 时，能够在获得更多可定量肽段的基础上，达到更好的定量准度和精度，而并未引起离子聚集现象。
MS2 碰撞能量
NCE 是一个无量纲数值，大致相当于质量数为 500、电荷数为 1 的参比离子的碰撞能（单位 eV）。实际使用的能量是根据所选母离子的质量和电荷数实时自动计算的。常用的 NCE 设置（e.g.，NCE 27–28）能够为肽段鉴定生成足够的碎片离子，不过事实证明它还不够使 TMT 报告离子解离并实现准确定量。然而碰撞能过大又会导致肽段过度碎裂，降低鉴定效率。14 通过研究发现，将碰撞能量从 NCE 30 提高至 NCE 32 能显著提高可定量蛋白质数而不会给鉴定效率带来负面影响（图 16）。 此外，高碰撞能还提高了定量分析的准确度（图 17）。因此，我们建议对 TMT-标记的样品使用比未标记样品高 4-6 NCE 的碰撞能。
MS2 隔离窗口
Q Exactive 类型的仪器通常建议使用 2 Th 的隔离窗口，能够保证足够的离子传输和灵敏度。然而，扩大隔离窗口会使干扰离子与母离子一并被隔离出来，降低了报告离子的定量分析准确性。
此外，干扰离子的碎片还有可能污染 MS2 谱图并导致鉴定得分降低。Q Exactive Plus MS 和 Q
Exactive HF MS 都配备了 AQT，使得其在非常窄的隔离窗口设置下也能实现有效离子传输。我们分别在 0.7 和 1.2 Th
的隔离窗口设置下对 E. coli 样品进行分析，其鉴定和定量结果非常接近（图 18）。
图 18. 不同隔离窗口设置下的可鉴定和可定量肽段组数。显示数据是 E. coli 样品进行两次平行分析的综合结果。
为了评估适用于复杂样品的隔离窗口，将纯 E.coli 样品（127C:128N:128C:129N:129C:130N 按 20:10:1:1:10:20 比例混合）与等量 HeLa 酶解样品 （通道 127N，127C 和 128N 按 1:1:1 比例混合） 混合作为背景。结果显示，受到 HeLa 酶解产物干扰影响的 E.coli 通道 127C 和 128N，其定量比值较理论值和其他无干扰的通道有明显偏差（图 19）。采用更窄的隔离窗口 （0.7 Th）可以减少共提取的干扰，定量精度略好于较宽窗口（1.2 Th）。对于高复杂度的样品，我们建议使用 Orbitrap Fusion MS 和 Orbitrap Fusion Lumos MS 仪器中的 SPS MS3 方法来获得高动态范围下的准确定量分析。此外，可以借助样品分级技术（e.g.，Thermo ScientificTM PierceTM 高 pH 反相肽段分离试剂盒，P/N 84868）来降低样品复杂度。
理论上还可以采用更小的隔离窗口 （0.4 Th）来提高 Q Exactive Plus MS 或 Q Exactive HF MS 的定量分析精度，但是其定量灵敏度也会受到影响。
图 19. 不同隔离窗口的定量分析精度，用可定量肽段组的定量比值中位数来表示。
总体来说，要在任何 Q Exactive 系列质谱仪上进行成功的 TMT 实验，都需要根据样品特点仔细选择相关参数。要达到高灵敏度和高精度的定量分析目标，建议考虑以下因素：
1）采用更长的洗脱梯度、更长的柱子和更高上样量。
2）为不同 TMT 标签调整 MS2 分辨率设置。
3）让最大注入时间与分辨能力相匹配以实现最优的质谱工作循环。
4）根据标签数提高 AGC MS2 目标，TMT10plex 最高可以设为 1e5。
5）在不会过度碎裂肽段的前提下提高 NCE 。
6）四极杆相对于传统方法更窄的母离子隔离窗口，更适合鸟枪法（shortgun）测序的应用。
结论
TMT
标记能够提高样品分析通量并支持高达十个不同的生物样品的相对定量，包括细胞、组织和体液。本研究用 TMTsixplex 和 TMT10plex
标记的 E. coli 细胞裂解液样品评估了 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS
仪器在蛋白质/肽段鉴定效率和定量分析精度方面的性能。
Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS
非常适合分析中低复杂度的样品。而对于高复杂度样品来说，最好能采用预分级的方式以提高定量分析精度和准确度。通过比较并优化多组不同参数设置，包括
MS2
分辨能力、最大注入时间、自动增益目标值和隔离窗口等，实现了最高的鉴定效率和最准确的定量分析。同时，本文还详细介绍了样品前处理和液相色谱等相关设置，以及如何采用
Proteome Discoverer 软件 2.1 版本进行数据处理的方法和流程。
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