图9:ESI注入8细胞阶段的胚胎。钝端毛细管
图10:EMBL转基因过程中使用的DMi8、Eppendorf TransferMan 4r显微操作器和PiezoXpert压电破膜仪。以钝端毛细管进行胚囊注射。DIC
用于小鼠转基因的CRISPR/Cas 9技术
用于小鼠转基因的CRISPR/Cas9技术为靶向突变提供了工具(如ESI),但无需繁杂的ES处理工作!(当然CRISPR也可以用于ES细胞突变)。
转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术是一种更为成熟的技术。TALE(转录激活子样效应因子)是结合DNA特定序列的蛋白质。TALE与核酸酶融合即为TALEN,这是一种具有高度特异性的DNA剪刀。TALEN使双链断裂。修复机制导致靶基因缺失或敲除。
目前,CRISPR技术相对于TALEN技术而言并不昂贵。
另外一种基因组编辑技术是锌指核酸酶技术,它通过在用户指定位置上造成DNA双链断裂而发生作用。
CRIPR/Cas9技术所用的工具如下所示:
向导RNA:这种RNA与用户修饰的靶DNA同源。向导RNA与DNA上的大约20个核苷酸结合。RNA链的其余部分用于结合Cas9核酸内切酶。需要对20个结合的核苷酸进行设计,以找到/发现靶序列。
Cas9核酸内切酶:切割效率高,有时甚至切割两个等位基因。
将向导RNA和Cas9蛋白(或Cas9的DNA或mRNA)注射到受精卵里,Cas 9切割DNA,修复机制开始起作用。该方法在第一代小鼠体内产生点突变的概率高。更先进的技术是注射携带靶基因或突变的同源DNA以及向导RNA/Cas9混合体。经由同源重组插入DNA相当有效。
小鼠转基因用CRISPR/Cas9的优点/缺点:
优点:
+ Cas 9切割效率非常高,有时甚至切割两个等位基因,即可获得同源1代小鼠!
+ 无需繁琐的ES细胞处理工作
+ CRISPR/Cas9技术不依赖于小鼠(而PNI和ESI则依赖),即它也可用于其他物种 (猪等)。
缺点:
- 迄今已公布的最长插入片段为3kB
- 目前lox P条件性敲除效率低
需要注射高浓度黏性分子(如RNA、蛋白质),会堵塞毛细管。因此需要更粗的毛细管,而且要求平角注射!
Cas9高效率地剪切DNA,DNA的修复机制造成了点突变。
*注射gDNA+Cas9+同源的DNA
图11:CRISPR/Cas9技术
典型的CRISPR/Cas9系统设置
与PN注射设置相同,以下除外:
将浓度较高的黏性CRISPR成分(RNA、蛋白质)注入受精卵时需要使用较粗的毛细管。这些毛细管结构笔直,内径较大,大多数实验室均制作。
因此极力建议沿着真正的平角方向注射(见图10),以避免胚胎受损。
此外,使用Piezo压电式破膜系统,可以更轻松地穿过透明带,尤其是质膜。
显微操作器水平移动,将目标片段注入悬浮细胞内
图12:受精卵注射过程的注射角度。显微操作器水平移动,零度角注射可使胚胎受损程度较轻。注射角度大于10° 将导致受精卵出现较大的“洞”,使其存活率降低。
徕卡显微操作器的移动角度可调,也就是说,即便角度较陡,注射角度本身也是零度角!
这是徕卡显微操作器的一大优点:黏性的向导RNA和cas9蛋白混合物所需的较粗毛细管(减少堵塞)可以沿着零度角方向注射!
其他实验室设备(转基因实验室)
-立体显微镜是选择和控制胚囊、ES细胞和毛细管必不可少的工具。(如TL5000、M80、Rottermann contrast)
图13:M80及TL5000 Ergo。PN注射后的双细胞阶段。
DIC专用玻璃底器皿,一些实验室使用大号盖玻片
毛细管:若干公司提供即买即用产品。许多转基因实验室自己制作毛细管。
直线注射CRISPR/Cas9需要使用内径足够大的毛细管。转基因专家自己制作“高级”毛细管以达到最高效率。
需要工具:
拉针器(如Sutter、Narishige)
磨具(用于毛细管拉拔后加工)
显微拉制仪(用于弯曲毛细管)
上述显微操作器:
徕卡机械式显微操作器:转基因领域赞誉颇高的显微操作器类型。角度可调,即使毛细管角度较陡,也可获得零度注射角。稳健可靠,负载能力强,持久耐用。用户众多。当移动徕卡显微操作器的控制杆时,可以感觉到毛细管触及胚胎。
Eppendorf TransferMan4r:全自动显微操作器,具有许多附加功能。可以平角注射。气压式、油压式、油压式带齿轮和Femtojet手动显微注射器经常用于其他显微操作器。性能最优,价格最高。
Narishige:新式Takanome显微操作器无平角操作功能。配备MOM-202D和MON-202D后可以平角操作。油压式显微操作器当然首屈一指。注射器:IM 9B、IM 9C、IM-11、IM300。
防震:在很大程度上取决于注射室位于地下室还是高层建筑的十层(不管需要与否)。采用被动(铁板、沉重石桌、网球等)和主动设置。
参考文献
One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering
Haoyi Wang, Hui Yang, Chikdu S. Shivalila, Meelad M. Dawlaty, Albert W. Cheng, Feng Zhang, Rudolf Jaenisch, Cell 153, 910-918, May 9, 2013
-Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system
Albert W Cheng, Haoyi Wang, Hui Yang, Linyu Shi, Yarden Katz, Thorold W Theunissen, Sudharshan Rangarajan, Chikdu S Shivalila, Daniel B Dadon and Rudolf Jaenisch, Cell Research (2013) 23:1163–1171. doi:10.1038/cr.2013.122; published online 27 Aug 2013