旷场实验相关-牙齿正畸移动模型大鼠三叉神经节内 P2Y2...

旷场实验相关-牙齿正畸移动模型大鼠三叉神经节内 P2Y2和P2Y6的表达变化

牙齿正畸移动模型大鼠三叉神经节内 P2Y2和P2Y6的表达变化

【摘 要 】 目的：研究大鼠牙齿正畸移动模型下，三 叉 神经节（trigeminal ganglion,  TG) 内嘌呤受体P2Y2 和 P2Y6 的表达变化，以探讨P2Y2 和 P2Y6 受体在正畸牙齿移动所致疼痛机制中的作用。方法：4 2 只 雄 性 SD 大鼠随机分为对照组和实验组，实验组再按加力后12h 、ld 、2d 、3d 、5d 、7d不同时间段分为6 个亚组，每组 6 只。实验组模型大鼠以80 g 力作用于大鼠上颌左侧第一磨牙，模拟临床矫治的牙移动过程。之后在不同时间点采用旷场实 验和试嘴行为检测大鼠发生疼痛的行为学表现，利用Western Blot方法检测T G 内 P2Y2、P2Y6 的表达变化，并分析其与疼痛发生的相关性。结果：模型建立后，旷场实验检测到一定的规律：即实验组大鼠前30s 通过的总线数、 5min内通过的总线数、5min内通过旷野中心的总线数、5m in内抬起行为的总次数这四组参数从12h开始下降， 2d降至最低,后逐渐上升至7d与对照组基本一致。5min内拭嘴行为的总时间自12h开始增高,2d升至高峰， 后逐渐下降至7d与对照组基本一致。Western  Blot检测结果显示:T G 内 P2Y2 和P2Y6蛋白的表达量自实验后12h开始逐渐升高至2 d 达到高峰，7 d 后下降至对照组水平。与对照组对比，1d、2 d 、3 d 组均有显著性差异（P <0.05) 结论：在大鼠牙移动过程中，T G 内 P2Y2 和 P2Y6 的表达变化呈现短时程的上调规律，推测P2Y2和P2Y6与牙移动后的痛行为学表现密切相关。

【关键词】正畸牙移动;三叉神经节;疼痛；P2Y2; P2Y6; 大鼠

疼痛是正畸治疗中常见的也是令正畸医生棘手的问题之一 m ，探讨口腔正畸疼痛的发生机制以及 寻求减轻或消除疼痛的方法是目前国内外正畸领域 的研究热点之一。三 叉 神 经 节 （trigem inal  ganglion, TG) 是外周感觉信息传人中枢的初级感觉神经节， 是感受颌面部伤害性刺激的重要结构，在其神经元上的一些核苷酸受体，可介导颌面部的伤害性感觉。三憐酸核昔（adenosine triphosphate，ATP) 已被发现作为信号分子在神经系统和神经胶质细胞中起着中介作用，ATP通过激活P2受体会产生一系列生理效应。P2 受 体 包 括 P2X ( 配体门控非选择性阳离子通道受体）和 P2Y( G 蛋白偶联受体）两大类。 现已发现了P丨3  ,4, 8 种P2Y 受体亚型 。 W eick等研究发现P2Y2受体表达于大鼠的TG神经元 内。在受损的TG神经元内可观察到P2Y 受体的表达量明显增多，提示三叉神经痛可能与P2Y 受体的表达有关。本研究拟通过大鼠牙齿正畸过程 中疼痛的产生与T G 内 P2Y2 和 P2Y, 表达变化的相关性分析来探讨正畸牙齿移动过程中疼痛发生的外周机制，为进一步研究P2Y2和P2Y6 受体在正畸疼痛机制中的作用奠定基础，也为研发新型的 颂面部镇痛药物提供理论依据。

材料和方法

1 材料

1 . 1 实验动物及分组选8周龄雄性S D大鼠共42只（第四军医大学实验动物中心提供，所有实验动物符合国际实验动物要求），体 重 200 ~ 250 g , 在安静环境中饲养48h以上。随机分为对照组和实验组 ，实验组按加力后12h 、ld 、2d 、3d 、5d 、7d 不同时间段又分为6 个亚组，每 组 6 只 。1 - 2 模型建立采用7 % 水合氯醛 （0.4  ml/100g ) 腹腔注射麻醉大鼠，之后在上颌左侧第一磨牙的牙颈部 、前牙唇面及轴角处磨出深约〇.2m m的固位沟 。将大鼠上颌左侧第一磨牙和前牙间用0.02mm 结扎丝拴正畸 用 N i Ti螺 旋 弹 簧 （0.01  inch) 。为防止弹簧脱落，用树 脂釉质粘结剂将固位沟内的结扎丝进一步固定。测力计测力 ，建 立 80g 正畸力作用下的牙齿移动模型。整个实验过程中忽略支抗的丧 失 ，实现以上领2 个中切牙为支抗，拉左侧第一磨牙向近中移动，实验组分别于加力后丨2  h 、l  d 、2  d 、 3  d 、5  d 、7  d 六个时间点处死动物，对照组大鼠于7 cl处死 ，之后迅速取实验组和对照组左侧三叉神经节。

2 方法

2 . 1 疼痛行为学检测

2 . 1 . 1 旷场实验将大鼠置于箱中（由上海欣软信息科技有限公司提供）， 每次1只。每 次均从箱子的右角开始 ，分别观察各组大鼠的行为学表现，同时记 录以下参数 ：每只大鼠前30S通过的总线数、5min内通过的总线数、5min内通过旷野中心的总线数 、5min内抬起行为的总次数。注意当大鼠4只爪子完全通过时才记为1条线。

2.1.2 拭嘴行为实验将实验大鼠放到箱中，每次一只，每只观察5  min, 用录像机分别记录对照组及实验组大鼠模型建立后 12h 、l  d 、2d 、3d 、5d 、7d 拭嘴行为反应 ，请未参加实验的观察者统 计5min 内大鼠拭嘴行为的总时间。

2.1.3 Western Blot检测 P2Y2和P2Y6受体的表达变化腹膜腔注射 7%水合氯醛（280mg/ kg) ，深麻醉后将大鼠开胸，用〇.01tnol/ L 的 PB S溶液迅速冲去血液 、并于冰上快速取出左侧TG，然后置人装有蛋白酶抑制剂（PM SF)及组织裂解液（RIPA) 的EP 管 内 ，将 E P 管放于冰上使用超声裂解仪充分匀浆组织 。充分匀裝后 12000  r/ m i n j T 离心15min。将上清液移人新的 1.5 mlEP 管内 ，用BCA 法进行蛋白定量，确定含10 |x g 及以上的蛋白 上 样体积 。蛋白样品采用1 0 % 的SD S -P A G E 进行电泳分离 ，加人预染蛋白 markei•，根据预染marker的位置确定所需蛋白 P2Y2 、P2Y6 及 p -a c tin 的位置，将胶上蛋白电转到 P V D F膜上做免疫杂交反应（P V D F 膜预先用甲醇溶 液 浸 泡 I  m in激活 ）。用 含 5 % 脱脂奶粉封闭2  h , 分别加入兔抗  P2Y2  Ig G( 1:200; Alomone  Labs . Jeru­salem)  ' 兔抗 P2Y6  Ig G( 1 : 200; Alonione  Lahs’Jerusa- lem ) ，4 t 孵 育 过 夜 后 使 用 TBS-T 洗 膜 10  min  x 3 次 ，加 人 H R P 结 合 的 驴 抗 兔 Ig G(  l : 5〇00;中杉，北京 ），室 温 下孵育1  h ; TBS-T 洗 膜 10  min x 3 次后，在Bk>-Racl成像系统中滴加化学发光液进行荧光条带扫 描 ，Image  L a b 软 件 分 析 荧 光 密 度 值 。依次使用 Stripping  Buffer 洗膜 30  m in、PBS 洗膜 10  min X 2 次 、 TBS-T 洗 膜 5  m in后 ，用 含 5 % 脱脂奶粉封闭2  h ，加人小鼠抗 P-a(‘tin  Ig G ( 1: 5000 ; Sigma, Germany) ，4 °C 孵育过夜后使用 TBS-T洗膜10 min x 3 次 ，加人H R P结合的驴抗小鼠 Ig G( l :5 0 0 0 ;中杉，北 京 ），室温下孵育1 h ;TBS-T洗膜 10  min  x 3 次 后 ，在 Bio- Rad 成 像系统 中滴加 化学发 光液进 行荧光 条带扫描 , Im age L ab软件分析荧光密度值。以 P2Y2、P2Y6 及 p -actin 的荧光密度值之比计算出各实验组大鼠与对照组大鼠的相对蛋白表达量。统计 学处理 ：使用 SPSS19. 0 软件进行统计分析 ，用 《检验比较对照组与实验组的行为学指标及P2Y2 与 P2Y6的表达差异 ，数据用均数±标准差 ( x ± s ) 表示 ，采用单因素方差分析进行组间差异的比较，以P <0.05表示差异有统计学意义。

讨  论

疼痛是正畸治疗过程中的一个常见反应 ，与其他急性损伤相比 ，正畸治疗中产生的疼痛具有周期短和强度低的特点。正畸疼痛不仅是一个复杂的生理问题 ，它还是一个心理的行为问题，影响正畸疼痛的因素有很多，包括医源性因素和个体因素 。医源性因素是指临床中使用不同的矫治方法 、不同的矫治器 、不同类型的弓丝等，都会对正畸疼痛产生不同的影响；而个体因素包括患者的年龄、性 別 、心理 、情绪 、注意力和遗传等诸多因素, 还有研究表明人们对疼痛的反应也会受到不同社会文化背景的影响。不同国家的正畸医生曾对于正畸过程中是否存在疼痛以及正畸疼痛与上述因素的相关性等问题进行过研究 ，但这些研究均来自于临床 ，患者的主观 感受多 ,影响因素颇复杂，结论亦不尽相同。因此 ，本研究试图通过动物实验进一步研究P2Y ，和 P2Y6受体在正畸疼痛及颌面部疼痛机制中的作用。

牙齿正畸移动模型建立后，实验组大鼠表现出明显的应激水平降低和试嘴行为的增多 ，后逐渐恢复至对照组水平 。此趋势与Yozgatian等的研究结果基本一致。正畸快速扩弓时每旋转螺旋扩大器 1 / 4 圈会产生2000 g 左右的力 ，根据大鼠牙齿是人类牙齿的 1 /2 0 计算，本实验选择80g力施加在大鼠磨牙上以模拟临床施加于患者的正畸重力，此力值未超过临床使用力值范围。本实验剔除了对牙齿正畸移动模型不敏感的大鼠。Y ang等已通过实验证明空白对照组与阴性对照组各行为反应变化无明显统计学意义，故本实验未设置阴性对照组。

在正畸力作用下，牙周膜内出现张力区和压力区 ，即使使用轻微的力量 ，也能造成牙周组织的损伤 。本实验结果显示，实验组P2Y2和P2Y6 受体的表达变化呈现一定的规律性：模型建立后12h 开始逐渐增加，2 d 表达量达到峰值 ，自3d开始表达量逐渐减 少 ，7d 时受体表达量几乎与对照组无异。郑 衍亮等临床研究发现：牙周疼痛发生时间在正畸加力后1 ~丨2 h不等 ，平均为4 ~ 5 h , 在2 4 ~ 4 8 h 疼 痛达到最高峰 ，加力后72h 疼痛程度才逐渐减 轻 。由此可以看出，本研究观察到的TG内P2Y2和P2Y6的变化规律与实际临床中所见的患者的疼痛规律呈一定的相似性。

生理学研究表明，头面部的伤害性信息是由TG内中等大小（600  ~  1200pm2) 和小神经元（<600 (jun* ) 传人的。Rodrfguez-Zayas  等曾报道 ，脊髓损伤后P2Y2的表达量在损伤2d后明显上调，直

至恢复正常 。M alin等报道 :敲除P2Y2 受体的小鼠对热痛存在 缺陷 。L i等h 5j 研 究 证 明 ，抑制P2Y2 受 体 对三 叉 神 经 痛模 型大 鼠可 以起到 镇痛作用 。以上实验均证实P2Y2在疼痛的形成及外周向中枢传导过程中发挥着重要作用。有研究报道 ，正畸矫治力使牙齿一侧组织受压另一侧受牵张，损伤可导致ATP释 放 ，作用于P2Y2和P2Y6受体并通过第二信引起IP3敏感钙库的 Ca2+释放 ，从而调节神经细胞的功能。本研究观察到P2Y2和

P2Y6的表达量在模型建立3d后开始出现降低 ，我们推测可能是 局部组织已逐渐适应外界刺激的原因 ，也说明P2Y2和P2Y6的表达变化可随刺激而变化，是短时间的效应，不是一个持续的变化，也印证了牙移动的一过性疼痛规律 ，与临床研究结果相符 ，提示 P2 Y2和 p2y6的表达在牙移动疼痛中可能发挥重要作用。 曹阳等研究 发现 , T G 内 P2X, 在实验性大鼠牙齿移动时表达呈上调趋势，其 表达在刺激后4 h开始增加,3d 时达到高峰，7d后下降至与对照组基本一致。本实验对P2Y受体两个亚型进行实验，P2Y2和P2Y6受体表达量高峰出现在2d , 较P2X3峰值出现早 ，是否是因为P2Y 受体家族较P2X受体家族能对伤害性刺激做出更迅速的反应，目前尚不十分清楚，需要进行深人研究。本实验还观察到P2Y2受体的 表达变化要比P2Y6略明显，推测P2Y2在致痛过程中可能较P2Y6 具有更重要的作用，而P2Y6是否在P2受体家族中起“先锋”作 用 ，以及P2Y6受体的激活是否对P2Y2受体的激活有一定的积极作用仍有待进一步深人研究。