LSPR技术在检测钙调素与NO合成酶靶向肽偶联动力学中的...

LSPR技术在检测钙调素与NO合成酶靶向肽偶联动力学中的应用

新一代SPR创新技术应用典型 ：LSPR技术在检测钙调素与NO合成酶靶向肽偶联动力学中的应用

钙调素(CaM) 是一个小分子的酸性  Ca²⁺ 偶联蛋白，参与很多的生理过程，钙调蛋白可以与很多不同的蛋白质结合，因此影响了细胞功能的方方面面。钙调蛋白参与介导的生命活动进程有炎症反应、代谢、细胞凋亡、肌肉收缩、细胞内运动、短期和长期记忆、神经生长以及免疫反应等。一些研究者还发现，钙调素可以在细胞核内发挥功能，其可能参与前mRNA的剪切和调控核糖体聚合及功能发挥。许多钙调素结合蛋白其本身不能结合钙离子，而钙离子在细胞的信号传导体系中作为重要的第二信使，所以这些钙调素结合蛋白就可以利用CaM来作为钙感应器和信号传导分子。

CaM能调整其主要区域和残基区域接触的方向以适应其和各种靶向蛋白和酶的偶联，CaM 与这些蛋白的靶向元件相互作用需要一定的酶的激活包括NO 合成酶 (NOS)。

Nicoya的个人型分子相互作用仪被证明能够很好地确定CaM 与NOS靶向肽相互作用动力学偶联常数 。为确定野生型（WT）CaM 和NOS 肽相互作用的结合、解离和亲和力常数 ，研究人员采用该个人型分子相互作用仪对两者之前的偶联动力学进行检测，将所获取的数据与文献上采用竞争偶联法获取的亲和常数进行对比分析，发现两者检测结果匹配度非常吻合。

• Nicoya个人型分子相互作用分析仪检测

【检测方法】：

将NOS靶向肽固定到芯片上，CaM做流动分析物，从最高浓度逐渐降低注入CaM浓度，多次分析后，用TraceDrawer 软件分析以确定结合率，解离率及亲和性，用1:1偶联模式均一化和拟合数据。

【结果】：

1、CaM偶联曲线的量级及结合斜率下降随着CaM浓度的降低，随着CaM浓度的降低，CaM 结合，解离及表面再生如图1所示：

图1各种浓度的CaM对固定的带SH末端的nNOS肽的偶联情况

2、在图1 中CaM偶联数据的动力学拟合获得的解离率为3.34x10^-4 s^-1 ，结合率为1.56x105 M^-1s ^-1，得到的亲和常数（KD)为2.20 nM

图2.   OpenSPR仪器在 CaM 和nNOS 肽之间的偶联动力学分析：用 TraceDrawer 的  1:1 偶联相互作用模式分析，结合率为1.56x10⁵ M^-1s^-1,解离率为3.34x10^-4

• 竞争法检测

2006年发表在J Biol Chem上的“Characterization of the calmodulin-binding domain of rat cerebellar nitric oxide synthase,”采用竞争法检测了钙调素和NO合成酶的相互作用，实验过程对钙调素与NO合成酶相互作用的比例做了滴定，并通过NO合成酶与CaM 竞争对PDE作用而影响PDE的活性，这个结果表明PDE与NO合成酶偶联的位点和PDE与CaM 主区域偶联的位点一致，实验结果并确定了肽的亲和常数为2.2nm。

图3.  CaM依赖的周期核酸磷酸       图4. cNOS在PH5.0的水溶液中一系列分配化酶被                                                      

cNOS肽抑制

图5.带TEF的cNOS肽溶于5mM柠檬酸溶液中的滴定图 图6.Ca²⁺-CaM和CaM-cNOS肽复合物吸收光谱

• 结论  ：

Nicoya个人型分子相互作用分析仪采用的是新一代LSPR无标检测技术，所获取的CaM-cNOS亲和常数2.2nM与2006年发表在J Biol Chem上通过竞争分析法获得的CaM-cNOS亲和常数2.2nM完全吻合，从而完美地验证了Nicoya无标记创新检测技术在CaM-cNOS偶联动力学研究中应用的可行性及可靠性。