报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,其表达产物非常容易被鉴定。把它的编码序列和基因调节序列相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。
作为报告基因必须具备的条件:
(1)全序列已测定
(2)表达产物在手提细胞中不存在,即无背景,在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物
(3)其表达产物能够进行定量测定
报告基因的种类很多,根据对其表达产物的分析检测方法的不同,可将其分为体外报告基因和体内报告基因。前者的分析需要在含有报告分子的细胞裂解液或细胞、组织培养液(分泌型报告基因)中进行报告分子的定量。较典型的有氯霉素乙酰基转移酶基因(CAT)、人生长激素基因(hGH)及分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP)等。后者的分析可以在活的细胞或组织中,或在已经组化固定的组织或细胞中进行。较典型的如绿色荧光蛋白基因(GFP)。而β-半乳糖苷酶基因(β-Gal)和萤火虫荧光素酶基因既可以在体外分析也可以在体内分析。
常用的报告基因系统:
√ 半乳糖苷酶报告系统
√ 荧光素酶报告系统
√ 荧光蛋白报告系统:
可溶性蛋白,性质稳定;
荧光基团相当明亮;
荧光在活细胞中即可观察,不需要固定和组织加工;
GFP基团和目的基因做成融合蛋白后,可以通过转染的方法在细胞中稳定表达;
表达GFP融合物的细胞能够在生活状态进行实验和检测。
报告基因 | 优点 | 缺点 |
氯霉素乙酰转移酶基因 (CAT) | 在哺乳动物中没有内源性活性;可用自动化的ELISA方法检测 | 线性范围窄;灵敏度相对较低;需要使用放射性同位素 |
β-半乳糖苷酶基因(β-Gal) | 蛋白稳定;生物或化学发光检测灵敏;不需要使用同位素 | 在哺乳动物细胞中有内源性活性 |
人生长激素基因(hGH) | 属于分泌型报告蛋白;操作简便 | 灵敏度相对较低;线性范围较窄 |
分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP) | 化学发光检测法非常灵敏;线性范围较宽;价格便宜 | 在某些细胞中具有内源性表达;与筛选的化合物相互干扰 |
荧光素酶基因(Luciferase) | 灵敏性好;线性范围宽;没有内源性表达;测定方法简便 | 蛋白的半衰期较短;常规分析重复性差 |
绿色荧光蛋白基因(GFP) | 自发荧光(不需要底物);没有内源性表达;有多种突变体可应用 | 需要翻译后加工;敏感性较低(没有信号的放大) |