老年性痴呆的动物模型及评价（五）

4.载脂蛋白E小鼠

ApoE4是与AD相关联的危险因素。ApoE4对含有APP突变的FAD有促进作用，但对具有PS突变的FAD却没有作用[64]。ApoE4与AD的 发病相联不仅在病例对照研究所支持[65]，而且家族性AD为基础相关研究中得到支持[66]。.现在认为，晚期发病的AD形式（发生于65岁以后）更为 普遍，这类AD病人的发病主要是与ApoE4有关，认为其参与了β淀粉样斑的形成。含有ApoE4表型的AD病人大脑中Aβ40和Aβ42免疫反应斑的水 平都比不含有ApoE4表型的AD病人的水平要高[32] 。

缺乏ApoE的小鼠与PDAPP小鼠杂交的后代表现出Aβ沉积显著的减少[67]。纯合子的PDAPP+/+ApoE+/+的小鼠6月龄时，海马与新皮质 出现了许多Aβ沉积，而PDAPP-/-ApoE-/-小鼠仅出现稀少的Aβ免疫反应。与PDAPP+/+和ApoE+/+鼠相比，PDAPP+/+ ApoE-/-小鼠的发生的沉积都是弥散斑。这个结果不能归因于改变的APP蛋白水平和APP代谢产生的Aβ，因为在2月龄时，两组的APP与Aβ水平没 有差别[67]。虽然它的分子机制还不是很清楚，却在淀粉样假说和ApoE4危险因子之间建立了联系。

ApoE敲除小鼠的记忆障碍和胆碱能神经元异常表明了ApoE和AD之间的另外一种联系。携带有ApoE4等位基因的AD个体中，观察到AchE神经元的 减少[37]。而缺乏ApoE的小鼠，通过生物化学和免疫组织学测量发现其海马与皮质中的AchE活性下降，其在Morris水迷宫的工作记忆下降 [68]。这种在Morris水迷宫中的空间工作记忆障碍和胆碱能标记物的下降能够被M1激动剂治疗3周所逆转[69]。然而，第二个ApoE敲除小鼠胆 碱能神经元研究发现，与配对的C57B1/6野生型小鼠相比，没有明显的胆碱能神经元数量和大小的减少及AchE活性的下降[70]。前一个研究中报道的 胆碱能缺陷可能是选择小鼠的遗传背景影响了胆碱能神经元生物特性 [71]。如果鼠系的精确遗传背景与已知和合适对照小鼠相比，那么从一个遗传背景到另一个遗传背景的结果不相一致性，最终是能提供有用的信息，这需要不同 遗传背景中确立一个遗传背景作为标准通用的转基因鼠系。人类遗传疾病中个体不同外显率可能是由于遗传背景中突变的相互作用造成的，可能对于某些危险因子， 如ApoE4基因的作用特别明显。ApoE-/-小鼠中的载脂蛋白基因敲除并替代成ApoE的异构体——ApoE3或ApoE4已表现出其在水迷宫测试中 出现的记忆力损害。在表达ApoE4的6月龄小鼠比对照小鼠或表达ApoE3小鼠，在水迷宫测试中在寻找隐藏平台方面有一个更长的潜伏期[72]。

5．Tau基因小鼠

AD两大病理改变除了SP外，另一个是NFT，其由高度磷酸化的微管相关蛋白tau构成的。正常的情况下，tau蛋白分布于轴突，结合微管和聚合的微管蛋 白，在轴突微管之间建立短的连接桥。AD病理条件下，tau被磷酸化重新分布于胞体和胞体树突室，在那里聚集形成丝状物（PHFs，pair helical filaments）。在疾病的晚期阶段，这些丝充满整个神经元胞体（NFT，neurofibrillary tangles）。SP和NFT能各自独立的发生，由tau蛋白聚集形成的纤维缠结在一些情况下与那些普通神经变性疾病中的纤维缠结难以区别，但在这些普 通神经变性疾病中几乎没有发现含有Aβ沉积物和SP。相反的，Aβ的沉积物能在认知功能正常的老年人中发现，但却没有纤维缠结的发生。也有一些不常见的 AD病理是“纤维缠结稀少”的类型，即很少的NFT而有丰富的Aβ沉积斑。由磷酸化tau构成的NFT存在于一些不含SP的神经退行性疾病，如 Pick’s 病、渐进性核上性麻痹、皮质基底退行性疾病和17号染色体相联帕金森综合征额颞叶痴呆（frototemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17，FTDP-17）。这些疾病的NFT分布不象AD只发生于神元内，还分布于胶质细胞中。到目前为止，在AD病人中并未发现在tau基因存在的异常改 变，而最近在FTDP-17中却发现了具有致病的tau基因突变[73]。

（1）人类野生型tau基因小鼠

目前APP和PS转基因模型小鼠不能形成tau丝，而当时与FTDP-17相联的tau突变还未发现，几个研究小组制作了人类野生型tau转基因小鼠。第 一个tau小鼠模型[74]表达的是长的四倍（four-repeat，4R）tau同型体——htau40，采用的是人Thy1启动子。使用全脑免疫杂 交的方法，发现人的tau基因的表达水平为内源性鼠Tau的10%。带有人的tau标记的神经元能在大脑大部分区域观察到，但它们的数量仍相对的少，只占 整个神经元的一小部分。和AD的一样，转基因鼠中人的tau存在于神经元胞体、轴突和树突。其磷酸化位点包括Ser202/Thr205和Ser396 /Ser404，能被针对相应磷酸化位点的tau蛋白抗体AT8和PHF1所确认。转基因鼠没有观察到tau蛋白丝的形成，而染色的tau为均质或粒状 的，而不是纤维状。另一个使用的是鼠3-羟基-甲基-戊二酰CoA还原酶启动子的转人最短tau同型体——htau44的小鼠也有相似的结果。总之，这些 人类野生型tau基因小鼠显示出AD相联紊乱疾病中NFT损害的早期改变，但却不能产生NFT和缺乏明显的神经病学症状。

（2）人类FTDP-17突变tau基因小鼠

目前已发现FTDP-17相联的tau基因三个突变位点P301L、V337M和G272V[75]，将人类FTDP-17突变tau基因导入小鼠中，进 行表达制作转基因小鼠。人类4Rtau基因同型体与突变型P301Ltau基因在鼠PrP启动子控制下，在JNPL3鼠系中得到表达[76]。该小鼠到 10月龄大时，90%的小鼠产生了运动和行为学紊乱，出现延迟的翻正反应并且最终不能进入直立状态。在悬挂实验中，小鼠短暂抓住绳子后就掉下，而转野生型 人tau的小鼠能用三个肢体和尾巴抓住保持不掉下。在出现症状两周以内，衰退扩展到所有的肢体，JNPL3小鼠几乎不能移动，出现张力障碍性体态。这些小 鼠体重减轻，梳理、发音和睁眼变得困难起来。而这些运动障碍使得这些小鼠不能在Morris游泳航行实验中进行测试。脑干、端脑和间脑中出现胶质细胞增 生，脊髓有48%的运动神经元减少。通过刚果红、Bielschowsky和Bodian银染方法在脑干、间脑、小脑和脊髓确认有NFT的形成。

6.其它的可用于制备转基因小鼠的基因 有报道其它的一些基因与AD的发病相关联，但大部分却是一个互相矛盾的数据。例如，有研究报道认为αI-抗凝乳蛋白酶与AD有关，而另外的研究却反对 [77]。对于极低密度脂蛋白受体、丁酰胆碱脂酶]和低密度脂蛋白受体]病例对照研究的结果也是互相冲突[78]。如果这两个与AD有关联的基因能导入 HLA-A2等位基因，将会给我们提供有用的信息。虽然TGF-β1在遗传学上与AD没有什么联系，但它在大脑损伤反应中扮演一个中心角色，小鼠大脑中的 星形胶质细胞增生反应时过度表达TGF-β1。hAPP和TGF-β1双转基因小鼠在2~3月时，大脑就出现了硫磺素S和Aβ免疫组化染色阳性，与大脑淀 粉样血管病变相似。而仅表达hAPP对照小鼠在2~3月时却没有观察到沉积，过度表达TGF-β1小鼠对hAPP的水平也没有影响[79]。如果新的与 AD发病有关的基因被确立，将会复制出具备更精确AD病理和症状的转基因动物。

转基因动物模型脑内出现了AD特有的病理改变Aβ沉积和SP，而FTDP-17突变tau基因小鼠出现了tau的病理改变，特别是NFT的形成，在AD动 物模型方面取得了巨大的进步，为针对SP和NFT方面的新药筛选提供了良好的动物模型。但建立转基因动物模型需要复杂的技术和高昂的费用，这类模型缺乏一 个衰老过程，不能完全具备理想AD动物模型特征，鼠系的遗传背景之间的差异导致同一类转基因鼠出现差异，重复性较差。因此，转基因模型要进一步推广应用， 尤其是在新药筛选和药理毒理学研究方面将受到很大局限。

四、以AD发病的环境因素为基础的动物模型

并不是所有的AD患者都具有阳性家族史，真正发生以上基因改变的患者所占的比例并不高，相当一部分患者从遗传学上是找不到任何线索，因此外界环境危险因素 在AD发病中也占有重要的地位。目前人们已发现一些环境因素能引起AD患者发病率升高。大体上包括生物因素（如病毒感染、高血压、糖尿病等）、物理因素 （如脑外伤等）和化学因素（如铝元素含量过高）。目前只有铝元素与AD发病的关系研究的比较多，并以此建立了铝元素慢性中毒的AD动物模型。

研究发现AD患者脑组织中铝含量增高，用原子吸收光谱仪测得铝在健康人脑中是1.8±0.8mg·g-1(脑组织干重)，AD患者脑内铝的含量是 3.6±2.9mg·g-1。而一般大于4mg·g-1即可引起神经细胞变性。游离铝可以自由通过嗅神经和血脑屏障进入脑组织的，在嗅球中含量最高，铝还 可以损害血管内皮细胞而破坏血脑屏障的完整性。铝进入脑内取代Ca2+和Mg2+，同氨基酸链上的谷氨酸和精氨酸结合形成谷氨酸铝盐或精氨酸铝盐的稳定复 合物，在大脑皮质、海马、杏仁核内富有谷氨酸神经元，铝多沉积于这些部位。铝在血液中可与转铁蛋白结合，在大脑皮质、海马、室中隔和颞叶杏仁处存在着许多 转铁蛋白受体，故铝易沉积于这些部位。动物实验结果表明，无论是家兔或大鼠经静脉、腹腔、皮下注射或是经胃肠道等途径给予铝化合物，均可见动物脑铝含量明 显增加，引起一系列行为异常，动物出现认知和记忆障碍的时间也早于其它指标。与幼年动物相比，铝的行为毒性多见于成年和老年动物，年龄越大，对铝的行为毒 性越敏感。铝的毒性引起脑内神经原纤维变性形成缠结已有许多报道。Deboni等给家兔皮下注射乳酸铝或酒石酸铝30天以上，可见脑干、大脑皮层及海马锥 体神经元中有NFT形成。其机制可能是铝能抑制蛋白磷酸酯酶2A和2B的活性，从而促使异常磷酸化的tau蛋白产生，继而导致NFT的形成。铝中毒可影响 脑内的神经递质的代谢，主要引起胆碱能神经元损伤，导致胆碱神经功能减退，引起学习记忆功能减退，对NE、5-HT、氨基酸及肽类等神经递质系统也有影 响。铝通过改变神经细胞的钙稳态，提高脂质过氧化损害细胞的作用，造成细胞结构和功能障碍，引起细胞的损伤和凋亡。铝引起脑内Aβ基因表达的增多也有报 道。钱亦华[80]等用AlCl3灌胃大鼠3个月建立老年性痴呆鼠模型，通过免疫组化的方法，发现其背海马结构内各部分均可见较多Aβ样免疫反应阳性神经 元，虽未有SP的形成，已说明铝引起Aβ在神经元内产生增多。铝引起Aβ在神经元内的沉积的机制可能与铝元素引起APP过度表达，Aβ过多的产生及铝元素 促进糖基与Aβ的定位连接有关。鉴于此，大多数学者认为铝在AD发病中起主要的作用，能够产生与AD相似的病理改变，形成铝元素中毒学说。 Mclachlan等还观察到三价金属螯合剂能减缓AD的病程[81]。但也有不少意见不同的报道，认为铝元素在AD发病中的并不是一个主要因素。而其它 的AD发病环境危险因素如何应用于动物模型，在动物身上研究其致病机理将是一个值得研究的课题。