病毒载体
经典的病毒载体主要有四类，腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒和慢病毒。他们具备侵染细胞谱广，效率高等特点并广为研究人员熟知。它们的特点总结归纳如表一。
表一：六大病毒载体技术的比较
| 载体 | 感染广谱性 | 靶细胞类型 | 表达形式 | 表达时间 | 免疫原性 | 外源片段容量(Kb) | 滴度(TU/ml) | 缺点 |
| 腺病毒载体 | 高 | 分裂和非分裂 | 非整合 | 2-4周 | 高 | 36 | 1012 | 免疫原性高，瞬时表达 |
| 腺相关病毒载体 | 中 | 非分裂为主分裂 | 非整合为主;整合 | 数年 | 无 | 4 | 1012 | 外源片段容量小 |
| 逆转录病毒载体 | 中 | 分裂 | 整合 | 数年 | 低 | 8 | 108 | 不能感染非分裂细胞 |
| 慢病毒载体 | 高 | 分裂和非分裂 | 整合 | 数年 | 低 | 5－8 | 1010 | 外源片段容量小 |
| 狂犬病病毒载体 | 对脑神经细胞侵染效率高 | 分裂和非分裂 | 整合 | 无 | ||||
| 昆虫杆状病毒载体 | 中 | 分裂 | 整合 | 数年 | 低 | 1012 | 感染谱数据库还有待丰富 |
病毒载体介导的基因传递的优势
通过表二，可以发现病毒载体介导的基因传导方法相比非病毒载体，具备高效，广谱，长期稳定表达以及能用于动物体内细胞等几乎所有优点。
表二：不同基因传递方法的比较
| 载体/方法 | 适用靶细胞类型 | 基因传递广谱性 | 动物体内基因传递能力 | 操作便捷性 | 细胞毒性 | 长期表达能力 | 引起免疫反应 |
| 化学试剂 | 1，部分贴壁细胞 2，部分悬浮细胞 | 低 | 极低 | 高 | 低到中 | 低 | 低 |
| 电转 | 1，部分悬浮细胞 2，部分贴壁细胞 | 中 | 可操作性低 | 中 | 低到中 | 低 | 无 |
| 病毒载体 | 1，几乎所有贴壁细胞 2，几乎所有悬浮细胞 3，几乎所有非分裂细胞 | 高 | 高 | 高 | 低 | 高 | 低到中 |
病毒制备和感染：
腺病毒：
腺病毒基因组非常大，而且酶切位点非常少，导致很难直接制备腺病毒载体。通常通过使用穿梭载体在细菌或者包装细胞系内进行重组从而将外源片段转移到病毒基因组中。
慢病毒：
外源插入片段一旦被克隆至慢病毒载体后，其两侧为长片段重复序列(LTR)以及
腺相关病毒：
腺相关病毒载体含有反向末端重复序列(ITR)。辅助质粒用来表达病毒包装必须基因(E2A, E4 VA and E1)。
注意事项：
插入片段大小和插入片段性质因素：一些插入片段的表达由于对宿主或者包装细胞系有毒性从而使得滴度比较低。在这种情况下，使用诱导表达系统。还有一些插入片段太大或者太小都可能导致病毒包装效率不高。 添加辅助序列增加插入片段的大小或者对病毒进行浓缩纯化提高滴度。插入片段如果过大可以选择容量更大的病毒包装系统。
小窍门：
构建分子病毒载体时，使用recA-细菌扩增病毒分子载体。当转染包装细胞时，尽可能使用传代次数低的细胞。
注意事项：
使用纯度尽可能高的质粒，最理想的是经过氯化铯密度梯度离心纯化的质粒。收获病毒后，推荐进行病毒浓缩并使用病毒纯化试剂盒或者氯化铯密度梯度离心纯化。
小窍门：
用病毒去感染细胞时，加入polybrene会增加感染效率
小窍门：
将病毒冻存在-80°C。但尽量减少冻融次数，推荐分装成单次使用量的小容量包装。避免反复冻融3次以上。
表三：化学，物理和病毒载体方法进行基因传递的具体优缺点比较
基因传递方法 优点 缺点
病毒载体 • 高感染效率，广谱性高 • 制备复杂
• 适合大规模实验操作 • 对病毒载体质量要求高
• 能高效感染体内细胞 • 需要低温(-80°C )储存
• 可以在体内感染特定细胞 • 价格偏高
• 易筛选细胞稳定株 • 部分病毒载体对基因大小有容量限制
化学方法 • 部分细胞转染效率高 • 广谱性不高
• 易操作 • 部分试剂毒性大
• 对转染基因大小容量限制小 • 体内转染效果差
• 试剂稳定，易储存
物理方法 • 对大部分体外细胞转染效率高 • 需要购买昂贵设备
• 易操作 • 体内转染可操作性差
• 不受基因大小限制 • 部分原代，非分裂细胞转染效果差
首页
