病毒载体
经典的病毒载体主要有四类，腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒和慢病毒。他们具备侵染细胞谱广，效率高等特点并广为研究人员熟知。它们的特点总结归纳如表一。
表一：六大病毒载体技术的比较
载体
感染广谱性
靶细胞类型
表达形式
表达时间
免疫原性
外源片段容量(Kb)
滴度(TU/ml)
缺点
腺病毒载体
高
分裂和非分裂
非整合
2-4周
高
36
1012
免疫原性高，瞬时表达
腺相关病毒载体
中
非分裂为主分裂
非整合为主；整合
数年
无
4
1012
外源片段容量小
逆转录病毒载体
中
分裂
整合
数年
低
8
108
不能感染非分裂细胞
慢病毒载体
高
分裂和非分裂
整合
数年
低
5－8
1010
外源片段容量小
狂犬病病毒载体
对脑神经细胞侵染效率高
分裂和非分裂
整合
无
昆虫杆状病毒载体
中
分裂
整合
数年
低
1012
感染谱数据库还有待丰富
病毒载体介导的基因传递的优势
通过表二，可以发现病毒载体介导的基因传导方法相比非病毒载体，具备高效，广谱，长期稳定表达以及能用于动物体内细胞等几乎所有优点。
表二：不同基因传递方法的比较
载体/方法
适用靶细胞类型
基因传递广谱性
动物体内基因传递能力
操作便捷性
细胞毒性
长期表达能力
引起免疫反应
化学试剂
1，部分贴壁细胞
2，部分悬浮细胞
低
极低
高
低到中
低
低
电转
1，部分悬浮细胞
2，部分贴壁细胞
中
可操作性低
中
低到中
低
无
病毒载体
1，几乎所有贴壁细胞
2，几乎所有悬浮细胞
3，几乎所有非分裂细胞
高
高
高
低
高
低到中
病毒制备和感染：
腺病毒：
腺病毒基因组非常大，而且酶切位点非常少，导致很难直接制备腺病毒载体。通常通过使用穿梭载体在细菌或者包装细胞系内进行重组从而将外源片段转移到病毒基因组中。
慢病毒：
外源插入片段一旦被克隆至慢病毒载体后，其两侧为长片段重复序列(LTR)以及
腺相关病毒：
腺相关病毒载体含有反向末端重复序列(ITR)。辅助质粒用来表达病毒包装必须基因(E2A, E4 VA and E1)。
注意事项：
插入片段大小和插入片段性质因素：一些插入片段的表达由于对宿主或者包装细胞系有毒性从而使得滴度比较低。在这种情况下，使用诱导表达系统。还有一些插入片段太大或者太小都可能导致病毒包装效率不高。 添加辅助序列增加插入片段的大小或者对病毒进行浓缩纯化提高滴度。插入片段如果过大可以选择容量更大的病毒包装系统。
小窍门：
构建分子病毒载体时，使用recA-细菌扩增病毒分子载体。当转染包装细胞时，尽可能使用传代次数低的细胞。
注意事项：
使用纯度尽可能高的质粒，最理想的是经过氯化铯密度梯度离心纯化的质粒。收获病毒后，推荐进行病毒浓缩并使用病毒纯化试剂盒或者氯化铯密度梯度离心纯化。
小窍门：
用病毒去感染细胞时，加入polybrene会增加感染效率
小窍门：
将病毒冻存在-80°C。但尽量减少冻融次数，推荐分装成单次使用量的小容量包装。避免反复冻融3次以上。
表三：化学，物理和病毒载体方法进行基因传递的具体优缺点比较
基因传递方法 优点 缺点
病毒载体 • 高感染效率，广谱性高 • 制备复杂
• 适合大规模实验操作 • 对病毒载体质量要求高
• 能高效感染体内细胞 • 需要低温(-80°C )储存
• 可以在体内感染特定细胞 • 价格偏高
• 易筛选细胞稳定株 • 部分病毒载体对基因大小有容量限制
化学方法 • 部分细胞转染效率高 • 广谱性不高
• 易操作 • 部分试剂毒性大
• 对转染基因大小容量限制小 • 体内转染效果差
• 试剂稳定，易储存
物理方法 • 对大部分体外细胞转染效率高 • 需要购买昂贵设备
• 易操作 • 体内转染可操作性差
• 不受基因大小限制 • 部分原代，非分裂细胞转染效果差
为什么是shRNA？
外源导入的siRNA结合RISC复合物的能力要比shRNA低10倍，虽然将siRNA的长度增加到29-30 nt可以增加结合RISC复合物的效率，但也增加了off target效应，引起更多的非专一性基因干扰。shRNA由于模拟microRNA的作用通路，所以相比siRNA其基因沉默效率更高。siRNA和shRNA的优缺点见表四。锐赛选择使用病毒载体介导的shRNA干扰，并通过构建shRNA稳定株，能最大程度的避免使用体外化学合成的siRNA所带来的一系列问题。
siRNA
shRNA
双功能shRNA
RNA干扰片段运输
进入体外细胞
难易程度
中等 (转染效率依细胞而定，差异大)
容易 (使用病毒载体)
容易 (使用病毒载体)
进入动物体内
细胞难易程度
低 (转染效率依组织特性而定，且需要较高剂量，可能引起off target效应)
容易 (使用病毒载体，发挥功能需要的拷贝数低)
容易 (使用病毒载体，发挥功能需要的拷贝数低)
进入细胞的方式
化学试剂转染
化学试剂转染；病毒载体转导
化学试剂转染；病毒载体转导
细胞内代谢速度
强(48小时内99%被降解)
弱
弱
作用机制
结合RISC复合物能力
弱
强 (10倍强于siRNA)
超强
达到沉默效果需要的拷贝数
高
低 (5个拷贝左右即可)
超低
脱靶效应
(off target effects)
化学修饰能力a
易修饰；修饰价格昂贵
无法修饰
无法修饰
免疫信号通路反应
中 (通过细胞质和内涵体通路激活先天性免疫系统)
弱 (由于使用与内源miRNA相似的干扰系统)
弱 (由于使用与内源miRNA相似的干扰系统)
外源核酸对细胞的毒性
中
弱
弱
对细胞内源RNA干扰系统的影响
中 (过量siRNA会增加饱和exportin-5运输内源miRNA能力的风险性)
中(瞬时转染引入的高剂量shRNA会增加饱和内源miRNA降解能力的风险性)，低(稳定转染)
中(瞬时转染引入的高剂量shRNA会增加饱和内源miRNA降解能力的风险性)，低(稳定转染)
表达可调控性
可控表达程度
(时间和空间)
低(可以通过结合特定的小分子或者大分子达到特异进入某类组织细胞的目的，但无法做到可诱导沉默)
高 (更换启动子)
高 (更换启动子)
安全性
体外和动物体内
高
高
高
临床
中
中
中
a: 1) 改善off target效应； 2) 提高细胞内稳定性
表六：不同转染方法介导的稳定整合参数比较
稳定整合参数
化学转染法
物理转染法
病毒载体法
转座子
磷酸钙转染
电转
逆转录病毒
(MLV)
慢病毒
腺相关病毒(Rep-)
腺病毒
睡美人
转座子
整合几率(integration event/PFU/cell)
10-8
10-6
10-2-10-1
10-2-10-1
10-3
10-6-10-4
10-2
整合位点
重复序
列片段
非核基质
-噜噗区
核基质区
CpG岛；
核糖体重复序列
由于整合率极低，所以很少
研究
TA位点
(染色体附近结构决定)
转录起始区
活跃表达
基因内
转录活跃区
表达调控区
整合位点
转录活跃度
低
低
高
高
中
高
稳定性
弱
中
强
强
拷贝数
多拷贝串联分布5-数百个拷贝
30%单拷贝
通过控制病毒载体用量
可以达到单拷贝
通过优化实验条件可以达到单拷贝
获得单拷贝细胞株的难易程度
难
中
易
易
易
易
表达强度/拷贝
低
低
高
高
高
高
插入失活宿主
内源基因
低
低
低
高
仍处于研究中
高
插入激活宿主
内源基因
低
低
高
低
低
表七：不同病毒载体介导的基因传导的特性比较
腺病毒
载体
腺相关
病毒载体
逆转录
病毒载体
慢病毒载体
狂犬病
病毒载体
杆状病
毒载体
表达形式
染色体外，
瞬时表达
染色体外，长期表达
整合
整合
整合
染色体外，瞬时表达
表达周期
2-4周
数月至数年
>1年
>1年
>1年
感染细
胞类型
分裂和
非分裂细胞
分裂和
非分裂细胞
分裂
分裂和
非分裂细胞
分裂和
非分裂细胞
昆虫细胞；
哺乳动物分裂细胞
细胞侵染
广谱性
广
对体内分化组织细胞侵染效果更好
广
广
高效感染脑神经细胞
中
可容纳外源片段大小
36kb
4kb
8kb
5-8kb
滴度
(TU/ml)
1012
1012
108
1010
1012
病毒制备
难易程度
中
难
中
中
中
中
常见应用
1，体外细胞基因转导
2，基因治疗
1，体外细胞基因转导；
2，动物模型；
3，基因治疗
1，体外细胞基因转导；
2，全基因组插入失活突变筛选；
3，功能细胞库构建
1，体外细胞基因转导；
2，基因治疗
1，体外细胞基因转导；
2，基因治疗
1，真核细胞蛋白表达(表达可溶性蛋白)
安全性
高
高
中
高
中
高
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