表 1:BSA 单体、二聚体和三聚体的测得分子量
三聚体 | 二聚体 | 单体 | |
RV 峰 - (ml) | 14.31 | 15.37 | 17.05 |
Mn - (kDa) | 203.8 | 135.2 | 66.4 |
Mw - (kDa) | 204.4 | 135.3 | 66.5 |
Mw/Mn | 1.003 | 1.001 | 1.001 |
Wt Fr(峰) | 0.054 | 0.165 | 0.78 |
图 4 显示了传统校正法的数据。 色谱图显示了碳酸酐酶(一种标准品)的折光率信号和生成的校正曲线。
图 4:碳酸酐酶色谱图与色谱柱校正曲线重叠。
采用传统校正法测定 BSA 二聚体和三聚体的分子量,结果见表 2,可与表 1 中的
SECMALS数据进行比较。 由于这些寡聚体的结构不再像单体那样是球状的,因此使用色谱柱校正法无法准确计算它们的分子量。
不使用光散射的情况下,无法得知使用色谱柱校正法测得的分子量是否准确。 同样地,这些峰可能被错误地鉴定为三聚体和五聚体。
但是,可通过精确地测定其分子量,使用光散射结果(表 1)正确地鉴定二聚体和三聚体。
表 2:使用色谱柱校正法测得的 BSA 寡聚体峰的分子量。
三聚体 | 二聚体 | |
RV 峰 - (ml) | 14.32 | 15.33 |
Mn - (kDa) | 341.1 | 198.4 |
Mw - (kDa) | 345.1 | 202.2 |
Mw/Mn | 1.012 | 1.019 |
Wt Fr(峰) | 0.021 | 0.103 |
最后,使用 SEC-MALS 和色谱柱校正法测定了另一种蛋白质(胃蛋白酶)的分子量。色谱图和光散射结果见图 5。 表 3 显示了测得分子量的比较结果。
图 5:胃蛋白酶的色谱图显示 RI(红色)和 SEC-MALS (90°)(桔色)检测器信号。
表 3:通过传统校正法和光散射技术测定的胃蛋白酶分子量
MALS | 色谱柱校正法 | |
RV 峰 - (ml) | 18.33 | 18.63 |
Mn - (kDa) | 34.6 | 38.5 |
Mw - (kDa) | 34.7 | 39.6 |
Mw/Mn | 1.004 | 1.028 |
使用 SEC-MALS 正确测得胃蛋白酶的分子量为 35
kDa,而使用色谱柱校正法却错误地测得分子量为 40 kDa。 造成这种结果的原因是胃蛋白酶的结构不是球状,因此比预计为球状蛋白质时的分子量大。
因此,它的洗脱时间较早,而且通过传统校正法记录的分子量比正确值略高。 另一方面,来自光散射的分子量不依赖于洗脱体积,因此可正确测量。
讨论
此应用说明表明,使用 Malvern SEC-MALS 20 系统可成功测定一些蛋白质的分子量。将 MALS 添加至 SEC 系统可实现蛋白质分子量的测定,不依赖于蛋白质的洗脱体积或结构。 使用 SEC-MALS 系统可以正确测量胃蛋白酶和 BSA 寡聚体的分子量,从而实现良好的表征。