2.3 蛋白质分析 为了分析AAV Rep和Cap蛋白质表达，按照2.2部分所述进行质粒转染。转染后48小时，将培养物刮到冷PBS/Mg(PBS含有5mM MgCl2)，细胞低速离心沉淀收获。细胞沉淀在冰上用200ml STM-NP缓冲液(25mM蔗糖,10mM Tris-HCl，pH8.0,10mM MgCl2,0.5%NP-40,1.0mM PMSF, 0.1Mm DTT)中裂解。裂解物2000´g离心5分钟获得核沉淀。核沉淀在200ml IPP缓冲液中重悬，冰浴45分钟并经常涡旋。核抽提物在14 000´g离心去除DNA和核碎片。上清液与SDS-PAGE样品缓冲液混合，100°C加热5分钟，14mA 10%SDS-PAGE凝胶分离过夜。用一个Trans-Blet SD 半干转移槽(Bi－Rad)转移蛋白质到硝酸纤维素膜上。滤膜在PBS溶解的2％奶粉阻断1-2h，随后用兔抗Rep（Trempe等，1987）或仓鼠抗Cap（American Type Culture Collection）一抗(含有1%奶粉的PBS稀释200倍)室温孵育2小时或4°C过夜。印迹用含有0.05% Tween-20的PBS洗涤3次，每次10分钟。合适的碱性磷酸酶缀合的二抗用含有1％奶粉的PBS稀释2000倍，室温下孵育孵育印迹1小时。用PBS-Tween-20缓冲液洗涤3次，印迹用溶解在二甲基甲酰胺的NBT和BCIP染色5－20分钟。
2.4 DNA分析 为了分析病毒DNA，包装转染按照2.2部分所述进行。转染后48小时，将培养物刮到冷PBS/Mg，低速离心收获。染色体外DNA用Hirt的方法(Hirt,1967)从细胞外分离。简单地说细胞沉淀在200ml裂解液(10mM Tris,pH8.0,1.0mM EDTA, 1.0%SDS)中重悬，加热40mg蛋白质酶K。37°C消化2个小时后，加入50ml 50M NaCl,冰浴4h。溶液在4°C 14000´g离心30分钟去除染色体沉淀。上清液用5ml RNase混合液(Ambion, 5mg RNase A,100单位RNaseT1)37°C处理2小时，用酚/氯仿(1:1)抽提1次，再用氯仿抽提1次。DNA用2倍体积的乙醇沉淀，用DpnI处理去除输入的质粒DNA。DNA在琼脂糖凝胶 上分离，按上述方法转移到硝酸纤维素膜上(Hirt,1967)，用Stratalinker (Stratagene)将其UV交粘到滤膜上。滤膜用gfp基因特异的32P探针 或者AAV特异的探针杂交。如前所述进行杂交和洗涤。用随机标记试剂盒制备杂交探针。膜暴露于X线胶片。 为了估计rcAAV的量，1´106 293细胞感染了Ad（m.o.i）和CsCl2纯化的野生型AAV或vAVgal的稀释液。用pAAV/Ad或pSH3/5作为辅助质粒转染制备的vAVgfp原液被用来转导Ad感染的细胞。48小时后，培养物被收获，病毒DNA被制备并通过琼脂糖凝胶电泳和Southern 杂交分析。
3.结果
3.1 用AAV/Ad辅助质粒的rAAV包装 制备重组AAV载体的最常用的实验方案包括用含有目的基因、病毒TR元件的AAV为基础的载体质粒和提供Rep和Cap蛋白质的辅助质粒共转染Ad感染的组织培养细胞。一个最常用的辅助质粒是pAAV/Ad(Samulski 等,1989)。这个方法的主要缺点是在载体原液中污染Ad、生成能够复制的AAV，而且整个过程的低效率。为了克服这些问题，我们构建了一个新型的含有AAV rep和cap基因以及Ad E2a,E4和VA的辅助质粒。当质粒与高度易转染的293细胞系联合使用(Graham等,1977)时，它含有Ad E1a和E1b基因，所有包装rAAV载体所需要的成分都存在。为了测试这些质粒是否能够包装一个AAV为基础的载体，我们用表达绿色荧光蛋白的pTR-UF5（Peel等，1997）质粒和辅助质粒共转染到293细胞中(Fig1A)，用的是lipofectamine的方法。为了确定两个质粒的最佳比例我们使用了几个不同比例。作为对照，我们同样使用了Ad-5(15m.o.i)感染293细胞，然后用载体质粒和pAAV/Ad作为辅助质粒转染它们。72小时后，按2.2部分的方法收获细胞、裂解准备转导。裂解液一式三份被用来转导Ad感染的Hela细胞。绿色荧光细胞3天后用荧光显微镜计数。几个实验的结果在Table1.列出。很明显在这些包装效率与pAAV/Ad辅助质粒相比较的实验中，我们用pSH3和pSH5质粒获得了更多的rAAV。我们用辅助质粒常规地比pAAV/Ad和Ad感染获得更多的rAAV。每个细胞的最高产出135T.U.比pAAV/Ad对照所获得的高80倍。在其它载体质粒比辅助质粒更多的比例没有产生大量的rAAV。随后用点印迹杂交确定的基因组拷贝数目揭示了颗粒－感染比率对于表达gfp的载体在Ad感染的Hela细胞中大约是100。这样这些实验获得的最高得率大约是每个细胞1.36´104 DNase抗性基因组。这些实验表明了pSH3和pSH5质粒完全支持无Ad共转染情况下高效率的rAAV包装。
3.2. Rep和Cap蛋白质表达 为了表明辅助质粒能表达AAV蛋白质，293细胞共转染了TR-UF5和不同的辅助质粒，如2.2部分所述。将这些培养物转染48小时后收获、裂解并用SDS-PAGE和免疫印迹分析。用Rep特异性抗体分析Rep蛋白质的表达(Fig.2A)发现pAAV/Ad(4和5道)的表达显著低于pSH3(6和7道)或pSH5（8和9道）(1:3或1:5比例使用)的蛋白质水平。在Fig.2A中，我们只指出Rep78和Rep52的位置，因为Rep68与一个交叉反应蛋白质共迁移(在Rep78下可以看到)而Rep40的水平太低不能在核提取物中检测到。用Cap特异性的抗体分析Cap表达(Fig.2表明当使用pSH3和pSH5辅助质粒与pAAV/Ad相比Cap表达显著增高。正如所预料的，在pTR-UF5（第2道）和pCDMRep（第3道）转染的培养物中没有capsid表达。更高水平的Cap蛋白质可以解释为pSH3和pSH5产生的rAAV的产率显著高于pAAV/Ad的。其它表明Cap表达水平对于rAAV的产率是有限的(Vincent等,1997;Li等,1997)。尽管来自pSH3和pSH5的Rep78水平显著高于来自pAAV/Ad，但我们没有发现载体产率的减小。Rep78的过表达表明对rAAV的产出有限制(Li等，1997；Vincent等,1997)。另外，在pSH3和pSH5的AAV蛋白质表达方面没有显著差别。
3.3.病毒DNA分析 为了分析这些新包装质粒所产生载体的量和类型，我们共转染了pTR-UF5质粒和不同的辅助质粒，如2.2部分所述。转染48小时后，收获细胞，分离染色体外DNA。低分子量的DNA被DpnI(降解未复制的质粒DNA)消化。消化后的DNA用琼脂糖凝胶电泳和gfp特异的探针(Fig.3A)或AAV特异的探针(Fig.3进行Southern杂交。在所有含有Rep蛋白质的DNA样品中都发现存在AAVRFM和RFD (Fig.3A: 2－8道)。复制的载体DNA水平在pAAV/Ad（Fig.3A，3和4道）pSH3或pSH5（Fig.3A，pSH3 5和6道，pSH4 7和8道）被用作辅助质粒时几乎是相同的。一个相似的膜被探针探测找有复制能力AAV，当使用的是pAAV/Ad时(Fig.3B，3和4道)发现了复制的DNA，但pSH3和pSH5被用作辅助质粒时却没有发现(Fig.3B，5和6道)。这些结果表明pSH3/5辅助质粒完全支持AAV载体DNA复制，但是与pAAV/Ad辅助质粒相比产生的rcAAV较少。 3.4. 有复制能力AAV的分析 尽管pAAV/Ad和pTR-UF5之间没有显著的同源性，有复制能力的AAV能够通过载体质粒和pAAV/Ad中rep和cap基因两侧的Ad末端之间的重组生成(Allen等,1997;Wang等,1998)。为了评估从辅助和载体质粒共转染生成的rcAAV的水平，Ad感染的293细胞感染了不断增加的m.o.i的野生型AAV或rAAV-gfp载体。转导2天后，分离低分子量病毒DNA，用放射标记AAV探针Southern杂交分析。当106 293细胞被感染了m.o.i为10-3（大约104基因组）野生型病毒时， AAV DNA被发现(Fig.4, 2道)。当细胞转导以用pAAV/Ad包装质粒制备的rAAV-gfp时，复制能力的AAV也被发现(Fig.4, 7道)。在Ad感染的细胞传代一次后，来自一个pAAV/Ad包装实验的rcAAV数量在104和105颗粒之间(由基因组拷贝数目所确定)。然而，在4个不同小规模rAAV-gfp制备中没发现有复制能力的AAV(Fig.4，8-11道)。利用相同的分析方式，从20´375px培养皿大规模制备rAAV b-gal载体时也没有能够发现rcAAV(Fig4 12－17道)。从这些凝胶中最大量的gfp载体(8.0´108颗粒)和最低量的野生型AAV（104颗粒）的分析，我们估计rcAAV污染的量小于每8.0´104载体颗粒一个基因组或载体浓度的0.00125%。随后的小和大规模载体制备实验中，Ad感染的293细胞中2次传代后分析了rcAAV污染，结果没有检查到污染。
4．讨论
从AAV 获得的基因治疗载体正被广泛应用于各种获得性疾病和遗传疾病。AAV载体的增殖被生成载体所需的耗费体力的方法所阻碍。这里，我们描述了一种新型辅助质粒的构建和分析，它允许无Ad载体的生成，并显著增加了重组载体的得率。辅助质粒含有Ad的E4、E2a和VA RNA基因以及AAV rep和cap基因。当导入到Ad E1a/E1b转化的293细胞后，所有所需的Ad辅助基因都提供了，使有效的载体扩增和包装能够进行。相似的方法已经有报道，Ad的辅助基因由质粒转染而不是病毒感染所提供(Grimm等,1998;Matsu***a等,1998;Xiao等,1998b)。完全没有Ad的污染，且简化了载体的纯化。Grimm等(1998)描述了一个类似我们的Ad辅助质粒的构建并用于包装的步骤。 用这种新辅助质粒获得了载体得率的增加。我们已经获得了超过每个转染细胞100个gfp表达载体的转导单位。点杂交分析揭示这与每个细胞超过104载体基因组的得率相对应。我们认为从pAAV/Ad质粒改进的pSH3/5辅助质粒的载体包装系统是由于(1)更高水平的AAV蛋白质表达(Fig.2)和(2)只导入2个试剂(载体和辅助质粒)到培养细胞中而不是3个试剂(Ad感染，载体和辅助质粒)。我们的新质粒比pAAV/Ad表达更多的Cap蛋白质，它可能完全解释载体产量的增加。据报道，高水平的Rep78表达会抑制载体的生成(Li等，1997；Vincent等，1997)。然而实验中来自pSH3/5的Rep78积聚水平比来自pAAV/Ad 的高，但来自pSH3/5的载体产出却更高。很明显，来自pSH3/5增加的Cap表达足以克服Rep78的抑制。早期AAV的研究估计每个感染的细胞能产生105-106基因组和104-105组织培养感染单位(Parks等,1967；Rose和Koczot，1972)。因此具有有进一步改进此载体系统的潜力。一个可能增加载体产出的修饰是用ACG替代ATG启动密码子以减少Rep的表达，它可以有效地增加载体产出(Li等，1997)。 另外一个AAV包装系统困扰载体生成的局限性是rcAAV的生成。尽管在大多AAV载体和辅助质粒之间不存在大范围 (>8bp)的同源性，rcAAV仍然因为非同源性重组而产生(Allen等，1997;Wang等,1998)。我们的辅助质粒含有与野生型病毒相同的AAV的cap和rep基因。因而，有可能由于非同源性重组产生rcAAV。然而，对我们的小规模和大规模制备进行的分析都没有发现任何rcAAV。Fig.4所示的实验是在Ad感染的Hela细胞后传代1次获得的结果。随后，实验制备的载体在Ad感染的细胞中传2次代未发现rcAAV。没有rcAAV是这个系统的显著优势，因为rep基因表达的病毒能够影响体内的转导结果(Halbert等,1997)。 我们研制的辅助质粒包括了一些以前发表的包装系统的改进。我们剔除了Ad的颠倒末端重复序列，它在pAAV/Ad辅助质粒包装AAV载体时表明产生了rcAAV(Wang等,1998)。通过将AAV rep和cap基因组装到一个也含有Ad辅助基因的质粒上，我们无需象其它系统一样(Matsu***a等,1998；Xiao等,1998b；Grimm等，1998)需要一个3个质粒的转染系统。Grimm等(1998)研制了一个类似的系统在同一质粒上携带AAV和Ad早期基因，并产生了相似水平的载体。总之，我们开发了一个改进的质粒转染系统来生成重组AAV载体。载体生成的简捷、载体得率的提高以及没有rcAAV 或Ad污染使得这个系统对于临床前期筛选多载体构建特别有用。
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