在使用温度梯度的方法寻找最佳复性温度时，新手往往会选择扩增产物最多的温度条件，然而在此后的非梯度扩增时扩增效果又不太理想。出现这种现象的主要原因是最佳复性温度的选择标准不对。本人10多年前做过数千个基因的扩增，通过温度梯度实验发现，能扩增出来的温度范围一般在3-30度。选择的标准应该是可扩增范围的中间温度。
因为：
1、扩增产物量的影响因素很多，有些是随机的。从定量PCR的平台期高低的不规律可以看出来
2、不同仪器、不同位置的温度及温度变化曲线是有差异的。按照仪器厂家的出厂标准也准确性+-0.3度及均匀性+-0.3度
3、PCR仪进行梯度扩增时的温度准确性会更差
选择中间温度可以消除仪器温度差的影响。
另外，进行温度梯度时模板量的选择也是非常重要的。
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