水环境污染生物监测——生物测试法（二）

2、发光细菌法

（1）方法原理

发光细菌是一类非致病的革兰氏阴性微生物，它们在适当的条件下能发射出肉眼可见的蓝绿色光（450~490nm）。当样品毒性组分与发光细菌接触时，可影响或干扰细菌的新陈代谢，使细菌的发光强度下降或不发光。在一定毒物浓度范围内，有毒物质浓度与发光强度成负相关线性关系，因而可使用生物发光光度计测定水样的相对发光强度来监测有毒物质的浓度。

国家标准（GB/T 15441——1995）中，以氯化汞作为参比毒性表征废水或可溶性化学物质的毒性，也可用半数有效浓度（EC₅₀），即发光强度为最大发光强度一半时的废水浓度或可溶性化学物质的浓度来表征；选用明亮发光杆菌T₃亚种作为发光细菌。因该菌是一种海洋细菌，故水样和参比毒物溶液应含有一定浓度的氯化钠。

目前，常采用新鲜发光细菌培养法和冷冻干燥发光菌粉制剂法。

（2）测定要点

①试验材料的准备：专用生物毒性测试仪，发光细菌琼脂培养液，液体培养基，0.02~0.24mg/L系列HgCl₂标准溶液，新鲜明亮发光杆菌T₃亚种或明亮发光杆菌冻干粉，化学毒物或综合废水等。

②新鲜发光细菌悬液的制备：从明亮发光杆菌的菌种斜管面中挑取一环细菌接种于新的发光细菌琼脂斜面上，待斜面长满菌苔并明显发光时加入适量稀释液并制成菌悬液；取0.1mL菌悬液接种于50mL液体培养基中，在22℃摇床震荡培养至对数生长中期（12~14h），用稀释液将菌悬液稀释成5×10⁷个（细胞）/[mL（菌悬液）]，置于4℃下保存备用。

③样品测定：将过滤去除颗粒物杂质的待测水样加入占水样质量3％的NaCl，依次加入稀释液和待测水样，恒温（20±0.5）℃后加入等量发光细菌悬液，依次测其发光强度。

④测试结果分析：根据测得的待测水样的发光强度计算其相对折光率。

3、致突变和致癌物检测

致突变和致癌物也称诱变剂，其检测方法有微核测定法、艾姆斯(Ames)试验法、染色体畸变试验法等。

微核测定法原理基于：生物细胞中的染色体在复制过程中常会发生一些断裂，在正常情况下，这些断裂绝大多数能自行愈合，但如果受到外界诱变剂的作用，就会产生一些游离染色体断片，形成包膜，变成大小不等的小球体(微核)，其数量与外界诱变剂强度成正比，可用于评价环境污染水平和对生物的危害程度。该方法所用生物材料可以是植物或动物组织或细胞。植物广泛应用紫露草和蚕豆根尖。紫露草以其花粉母细胞在减数分裂过程中的染色体作为诱变剂的攻击目标，把四分体中形成的微核数作为染色体受到损伤的指标，评价受危害程度。蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量多，对诱变剂反应敏感。

Ames试验是利用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的组氨酸营养缺陷型菌株发生回复突变的性能来检测被检物是否具有致突变性。这种菌株均含有控制组氨酸合成的基因，在不含组氨酸的培养基中不能生长，但如果存在致突变物时，便作用于菌株的DNA，使其特定部位发生基因突变而回复为野生型菌株，能在无组氨酸的培养基中生长。考虑到许多物质是在体内经代谢活化后才显示出致突变性的，Ames等人采用了在体外加入哺乳动物肝微粒体酶系统(简称s一9混合液)使被检物活化的方法，提高了试验的可靠性。

色体畸变试验是依据生物细胞在诱变剂的作用下，其染色体数目和结构发生变化，如染色单体断裂、染色单体互换等，以此检测诱变剂及其强度。