a.脂多糖屏障丢失(rfa)。用接种环或一端翘起的接种针以无菌操作取各菌株的增菌培养液,在营养琼脂平板上分别划平行线,然后用灭菌尖头镊夹取灭菌滤纸条,浸湿结晶紫溶液,贴放在平板上与各接种平行线垂直相交盖好皿盖后倒置于37℃恒温箱,培养24h后若纸片周围出现抑菌带,则说明测试菌株含有rfa突变。
b.R因子。TA97、TA98、TA100和TA102菌株都含有R因子,这是一个抗药性转移因子。检测R因子存在的方法:横过营养琼脂平板表面涂一条小剂量氨苄青霉素钠溶液,将测试菌株与之交叉划线,37℃培养12~24h,不含R因子的菌株在氨苄青霉素的扩散区受到明显抑制,无细菌生长,而含有R因子的菌株则不受其影响。
c.紫外线损伤修复缺陷(△uvrB)。在营养琼脂平板上按上述方法划线接种后,一半接种线用黑玻璃遮盖,另一半暴露于紫外光下8s,然后盖好皿盖并用黑纸包裹平皿,防止可见光修复作用。培养同上。
d.自发回变。预先制备底平板,向灭菌并在水浴内保温45℃的上层软琼脂中注入0.1mL菌液,混匀后倾于底平板上并铺平。平皿倒置于37℃温箱培养48h。所有菌株在一定培养条件下都有相对稳定的自发回变率超过允许范围应视为异常。几种常用菌株的自发回变率分别为:TA97 90~180;TA98 30~50;TA100 120~200;TA102 240~320。
e.回变特性一诊断性试验。上层软琼脂中除菌液外,还注入已知阳性物的溶液,需活化系统者再加入S9mix,其他同上。
菌株鉴定正确结果见表
②测定步骤
a.培养基的接种。取底层培养基平板4皿;融化上层培养基4支,置于45℃下保温。
分别在每一支上层培养基中分别加入鼠伤寒沙门菌TA98菌株,并加入在37℃培养7h的菌液0.1mL,混合均匀后逐次、迅速倒入底层平板中。
b.施毒。用镊子将厚的圆滤纸片放入每个皿中心,并在其中三皿中的滤纸上,分别加入50mg/L、250mg/L、500mg/L的亚硝基胍(nitrosoguanidine,NTG)各0.02mL,即每皿分别含NTG 1μg、5μg、10μg,第四皿作为空白对照。
c.观察结果。将平皿在37℃黑暗处培养2d后,记录结果。
③结果分析。确定待测化合物在不同浓度时的相对致突变性。TA98菌株在天然条件下会出现自发回复突变(his-),可以在不含组氨酸的底层培养基上生长,故可以对照平板上出现的菌群(自发回复突变)为基准,比较待测物的致突变性。
阴性(一):出现的诱发回变菌落数为自发回变数的2倍以下。
弱阳性(+):诱发回变菌落数为自发回变数的2~10倍。
阳性(+):诱发回变菌落数为自发回变数的10~50倍。
强阳性(+++):诱发回变菌落数为自发回变数的50倍以上。
Ames认为,待测物每皿浓度高达500μg亦不引起大量回变者,为阴性结果。
特别需要指出的是:
a.斑点试验只局限于能在琼脂上扩散的化学物质,大多数多环芳烃和难溶于水的化学物质均不适宜用此法。此法敏感性较差,主要是一种定性试验,适用于快速筛选大量受试化合物。
b.平板掺入试验可定量测试样品致突变性的强弱。此法较斑点试验敏感,获阳性结果所需的剂量较低。斑点试验获阳性结果的浓度用于掺入试验(每皿0.1mL),往往出现抑(杀)菌作用。
c.试验作为检测环境诱变剂的一组试验中的首选试验,广泛应用于致突变化学物的初筛。但该试验程序还较繁琐,方法不够简便,有待于快速灵敏、简单易行的环境诱变剂短期生物测试法早日问世。
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